A formação de pseudo-hifa em linhagens diploides acontece em resposta à depleção de nitrogênio no meio, enquanto células haploides produzem filamentos que possuem a capacidade de invadir meios ricos contendo ágar. Ambas as características estão vinculadas à expressão do gene FLO11, que em condições pobres em fonte de nitrogênio é regulado através da via das MAP quinases (LO; DRANGINIS, 1998). Atualmente, sabe-se que leveduras diploides também são capazes de formar filamentos e invadir meios contendo ágar em fenômenos relacionados ao dimorfismo celular. Modificações na organização da colônia em resposta ao estresse do ambiente, também são desencadeadas pela depleção de aminoácidos e de glicose. A habilidade de invasão de meios pode prover uma vantagem seletiva a células não-móveis de S. cerevisiae, facilitando o escape dos ambientes estressantes, assim como ir à busca de nutrientes (ZUPAN; RASPOR, 2010). As células de leveduras tendem a ser invasivas e formar filamentos em meios contendo fontes de carbono complexas, como rafinose ou amido. Mas, foi visto que mesmo em meios contendo glicose, frutose ou manose como fonte de carbono, após um longo período de incubação, as células tornaram-se invasivas e filamentosas (CECCATO-ANTONINI, 2008).
Desta forma, foram realizados ensaios de crescimento invasivo em meio rico YP acrescido de 20 g.L-1 ágar, contendo glicose ou sacarose como fonte de carbono, em concentrações distintas (20 ou 200 g.L-1). As placas foram incubadas a 28 oC, por 5 ou 10 dias, no intuito de depletar a fonte de carbono e de induzir a formação de filamentos.
As linhagens CENP.K2-1C e CFY05B apresentam um crescimento invasivo muito discreto em meios contendo 20 g.L-1 da fonte de carbono e nenhuma invasão em meios contendo 200 g.L-1, o que provavelmente é explicado pela depleção mais rápida da fonte de carbono e de nitrogênio, quando inicialmente a concentração desta é menor. Este comportamento foi verificado em ambos os períodos de incubação, 5 ou 10 dias (Figura 30 A e B). Ao que tudo indica, após a depleção da fonte de carbono, a célula tende a utilizar seu produto de metabolismo e o restante da fonte de nitrogênio como fonte de energia. Ao crescermos a levedura em 20 g.L-1, após 5 ou 10 dias, as concentrações de ambas as fontes provavelmente encontram-se esgotadas e como descrito anteriormente, depleção de nitrogênio causa invasão. Isto explicaria a leve diferença encontrada para os fenótipos demonstrados pela linhagem de laboratório.
Figura 30 – Crescimento invasivo das linhagens analisadas em meio rico YP acrescidas de 20
g.L-1 de ágar, em diferentes fontes de carbono.
As linhagens foram crescidas em placas de meio rico YP contendo diferentes fontes de carbono (glicose ou sacarose) em diferentes concentrações (20 ou 200 g.L-1), e 20 g.L-1 de ágar por (A) 5 ou (B)
10 dias, a 28 oC.
Fonte: Figueirêdo (2012)
Em relação às linhagens FT02 e CFY02B-B, a capacidade invasiva aparece de formas distintas. A linhagem FT02 demonstra-se invasiva em todas as condições testadas, ou seja, possui crescimento invasivo independentemente da fonte de carbono e de sua concentração e também do período de incubação. Já sua derivada flo8, apresentou-se não-invasiva em meios contendo 20 g.L-1 da fonte de carbono e invasiva em meios contendo 200 g.L-1 da fonte de carbono, para ambos os períodos de incubação testados, indicando uma invasão regulada pela concentração da fonte de carbono. Como o etanol pode aumentar o poder invasivo de uma célula (CECCATO-ANTONINI, 2008), o crescimento em maiores concentrações da fonte de carbono, gera uma maior concentração de etanol, o qual induziria com mais eficiência a invasão celular que as mesmas fontes em menores concentrações.
Além da análise de crescimento invasivo em ágar, realizamos análises microscópicas de amostras celulares confeccionadas a partir das placas utilizadas no ensaio de crescimento invasivo. Nestas análises, foram levadas em consideração a morfologia (ovoide ou alongada) e o arranjo celular (forma planctônica ou em forma de flocos).
Corroborando com os resultados do ensaio de crescimento invasivo em ágar, as linhagens CENP.K2-1C e CFY05B apresentaram-se sob a forma ovoide e planctônica em todas as amostras analisadas, o que confirma a sua incapacidade de formar filamentos e de invasão celular (Figura 31 A e B).
Quando analisamos as amostras da linhagem FT02, pudemos notar uma grande quantidade de células pouco alongadas e em forma de flocos, em todas as condições de cultivo testadas. Quanto à linhagem CFY02B-B, notamos que a deleção do gene FLO8 praticamente extinguiu a formação de flocos. Em sua maioria, as amostras apresentaram células ovoides. Entretanto, em meios com 200 g.L-1 de fonte de carbono, em períodos mais prolongados de incubação, observou-se células mais alongadas e menos ovoides, mas sem a formação de flocos, o que corrobora com a capacidade invasiva em ágar nestas condições. As células da CFY02B-B incubadas por 5 dias e crescidas em 200 g.L-1 de fonte de carbono, apresentaram capacidade invasiva em ágar, mas sob a forma ovoide e planctônica na amostra coletada. A morfologia observada, provavelmente, deve ser a predominante da camada superior de células das colônias. Camadas mais internas e presas ao ágar devem encontrar-se sob a forma mais alongada, tendendo à formação de pseudo-hifas.
Figura 31 – Análise microscópica das linhagens parentais (FT02 e CENP.K2-1C) e modificadas
(CFY02B-B e CFY05B).
Esta análise microscópica utilizou amostras das linhagens semeadas em placas de meio rico YP acrescido de diferentes fontes de carbono (glicose ou sacarose) em diferentes concentrações (20 ou 200 g.L-1). As placas foram mantidas a 28 oC por durante (A) 5 dias ou (B) dias. Alíquotas destes crescimentos foram analisadas em microscópio confocal, utilizando luz transmitida, objetivando a morfologia e o arranjo celular.
Fonte: Figueirêdo (2012).
Sabe-se que a diferenciação celular em pseudo-hifa e filamentação é induzida por sacarose e por glicose. Entretanto, a sacarose mostra-se mais eficiente nesta indução, menores concentrações de sacarose sendo necessárias para promoção deste fenótipo que a glicose, o que acontece via receptor Gpr1p e AMPc-PKA (VAN DE VEELDE; THEVELEIN, 2008).