Cromatografia de Interação Hidrofóbica (CIH)

O interesse crescente pelos processos de purificação de biomoléculas deve- se principalmente ao desenvolvimento da biotecnologia e à demanda das indústrias farmacêuticas, químicas e de alimentos por produtos com alto grau de pureza.

Há uma variedade de procedimentos para processos de purificação de peptídeos antimicrobianos produzidos por bactérias. Esta grande variedade se deve à natureza extremamente heterogênea destes peptídeos (LISBÔA, 2006). A natureza catiônica e hidrofóbica das bacteriocinas é utilizada para sua recuperação dos meios de cultura.

Embora existam diversas técnicas para a purificação de proteínas, têm-se aplicado diferentes tipos de cromatografias devido ao seu alto poder de resolução. O termo cromatografia refere-se a um grupo de técnicas de separação as quais

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são caracterizadas pela distribuição das moléculas a serem separadas entre duas fases, sendo uma estacionária e a outra móvel. A seleção do tipo de cromatografia depende das características biológicas e físico-químicas da proteína: massa molar (cromatografia de exclusão molecular ou filtração em gel), carga elétrica (cromatografia de troca iônica), características bioespecíficas (cromatografia de afinidade) e hidrofobicidade (cromatografia de interação hidrofóbica) (QUEIROZ; TOMAZ; CABRAL, 2001).

A CIH é uma metodologia aplicada na purificação de biomoléculas, sendo uma forma de cromatografia de interação multivalente, complementar a outras técnicas de separação (PASSARINHA; BONIFÁCIO; QUEIROZ, 2007).

A interação hidrofóbica tem grande importância nos sistemas biológicos. É a força dominante na estabilização da estrutura biológica da proteína e têm um papel importante em outros processos biológicos como reações antígeno-anticorpo, reações substrato-enzima e na manutenção da estrutura da bicamada lipídica da membrana biológica (QUEIROZ; TOMAZ; CABRAL, 2001).

O método da CIH baseia-se na interação hidrofóbica ou na associação entre região apolar da proteína e ligantes hidrofóbicos imobilizados em suporte sólido. A ligação é induzida sob elevadas concentrações salinas, as quais reduzem a solubilidade de proteínas, bem como aumentam o nível de entropia na camada de moléculas de água que envolvem grupos hidrofóbicos. As proteínas são eluídas da matriz hidrofóbica por redução da força da ligação hidrofóbica mediante mudanças na fase móvel, como diminuição do teor salino, ou por alteração da conformação da proteína (por exemplo, detergentes suaves ou baixas concentrações de agentes desnaturantes) (PESSOA JR.; KILIKIAN, 2005).

A CIH é uma técnica não desnaturante para proteínas, pois não requer o uso de solventes orgânicos na eluição, como na cromatografia de fase reversa. Utiliza fases estacionárias moderadas, e o sal presente no eluente geralmente tem um efeito estabilizador nas moléculas; assim, a manutenção da integridade estrutural da biomolécula é a principal vantagem desta técnica (DIOGO et al., 2003).

A fase estacionária e a fase móvel fluida na coluna têm fundamental importância na eficácia da cromatografia. Os ligantes largamente utilizados na constituição da coluna de CIH diferem no tipo, no comprimento da cadeia e na densidade do ligante, como também no tipo de matriz. As características da fase

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móvel fluida que interferem nos resultados da cromatografia são: o tipo e a concentração do sal, o pH, a temperatura e os aditivos. Sais como cloreto de sódio ou sulfato de amônio são os mais efetivos para promover a interação ligante- proteína devido ao efeito da precipitação salina ou aumento da tensão superficial molar (CHIARINI, 2002).

As técnicas cromatográficas estão presentes em inúmeros processos de purificação de biomoléculas. Ahmad et al. (2010) utilizaram cromatografia de troca- iônica e fase-reversa para a purificação de uma nova bacteriocina, bifidina I, produzida por B. infantis, possibilitando posterior análise em espectrometria de massa para determinação da sequência de aminoácidos primários. Pesquisadores (OH et al, 2006) purificaram, em cromatografia de interação hidrofóbica, uma bacteriocina produzida por Lactococcus sp. HY 449 para avaliar sua atividade antimicrobiana em bactérias que causam inflamação na pele, como

Objetivos

3. OBJETIVOS

3.1 Objetivo principal:

Produção do lantibiótico nisina em leite desnatado diluído UHT por

Lactococcus lactis subsp. lactis ATCC 11454, em biorreator.

3.2 Objetivos específicos:

• Estudo quantitativo da produção de nisina por Lactococcus lactis utilizando leite bovino desnatado diluído UHT, na concentração de 25% (2,27 g sólidos totais) com relação a padrão, em cultivos descontínuos a 30oC por 52 horas. • Avaliar os parâmetros de agitação e aeração em biorreator, para estabelecer

as melhores variáveis estudadas para a produção nisina: (i) 100 rpm – sem aeração e 0,5 L.min-1 e (ii) 200 rpm – sem aeração, 0,5, 1,0 e 2,0 L.min-1. • Determinar o kLa em leite desnatado diluído como condição operacional de

scale-up no cultivo de células de L. lactis e produção de nisina.

• Avaliar o fenômeno de adsorção de nisina pelas células produtoras durante os cultivos.

• Estudo preliminar da atividade biológica de nisina produzida em biorreator posterior ao processo de liofilização.

• Estudo preliminar da atividade de nisina após purificação por cromatografia de interação hidrofóbica.

Material e Métodos

4. MATERIAL E MÉTODOS

4.1 Microrganismos

A cepa de Lactococcus lactis subsp. lactis ATCC 11454, bactéria produtora de nisina e a cepa de Lactobacillus sakei ATCC 15521, bactéria sensível à ação de nisina, foram mantidas a -80ºC em caldo MRS (De Man, Rogosa, Sharpe; Difco, Detroit, EUA) (DE MAN; ROGOSA; SHARPE, 1960) adicionado de 40% de glicerol. Ambas as cepas foram adquiridas da Coleção de Culturas Tropical (CCT) da Fundação André Tosello - Pesquisa e Tecnologia (Campinas/SP) e estão disponíveis no American Type Culture Collection.

4.2 Meios de cultivo

Foi utilizado o meio Caldo MRS (Tabela 4.1) para o preparo do inóculo, o meio ágar soft MRS, composto de Caldo MRS adicionado com 0,8% de ágar bacteriológico, para a detecção da atividade de nisina pelo método de difusão em ágar, e o ágar MRS, para estudos da viabilidade celular. Todos os meios de cultura foram adquiridos da DIFCO LABORATORIES (Detroit, EUA) e preparados conforme especificações do fabricante. Leite desnatado UHT “ultra high

temperature” Dietalat Premium (Parmalat, Brasil) na concentração padrão de

9,09 g de sólidos totais por 100 mL, foi diluído em água destilada, para uma concentração de 25% (2,27 g de sólidos totais por 100 mL), pH 6,7 e utilizado para cultivo em biorreator em todos os ensaios (Tabela 4.2).

Material e Métodos

Tabela 4.1- Composição do meio de cultivo Caldo MRS (informação fornecida pelo

fabricante do Caldo MRS - DIFCO).

Composição g.100mL-1 Proteose peptona nº03 1,0 Extrato de carne 1,0 Extrato de levedura 0,5 Dextrose 2,0 Tween 80 0,1 Citrato de amônio 0,2 Acetato de sódio 0,5 Sulfato de magnésio 0,010 Sulfato de manganês 0,005 Fosfato dipotássio 0,2 Sólidos totais 5,5

Tabela 4.2- Composição do meio de cultivo leite desnatado (informação fornecida

pelo fabricante do leite desnatado UHT Dietalat da Parmalat, Brasil).

Composição Concentração Padrão (g.100 mL-1) 25% da concentração Padrão (g.100 mL-1) Carboidratos 5,0 1,25 Proteínas 3,0 0,75 Gorduras totais 0,33 0,0025 Gorduras saturadas 0,05 0,03 Colesterol 0,0025g 0,0625 Fibra Alimentar --- --- Cálcio 0,20 0,05 Ferro 0,001 0,12 Sódio 0,5 0,0125 Vitamina A 0,006 0,0015 Vitamina D 0,00038 0,000095 Sólidos totais 9,09 2,27

Material e Métodos