CAPÍTULO 2 REVISÃO BIBLIOGRÁFICA
2.4. Cromatografia de interação mista: aminas como ligantes
As aminas são compostos químicos orgânicos nitrogenados derivados da amônia. Podem ser primárias, secundárias ou terciárias dependendo do número de radicais alquilas ou arilas ligados ao nitrogênio. O átomo de nitrogênio da amina apresenta um par de elétrons não compartilhado, o que explica seu comportamento básico e nucleofílico (KLEIN, 2012).
A basicidade entre as aminas pode ser comparada através de sua constante de dissociação (Ka), fornecida pela equação:
+ + + ↔ +H O RNH H O RNH3 2 2 3 ] [ ] ][ [ 3 3 2 + + = RNH O H RNH Ka a a K pK =−log
Quanto maior for o valor do pKa de uma amina (menor Ka), maior será seu caráter básico,
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enquanto as aril aminas apresentam valores mais baixos de pKa, sendo menos básicas (KLEIN,
2012; SOLOMONS et al., 2014).
Devido à sua estrutura e suas propriedades, as aminas e poliaminas (que apresentam mais de um grupamento amina) podem ser utilizadas como ligantes em cromatografia líquida. Há relatos na literatura que estes ligantes apresentam baixo custo, alta estabilidade, capacidade, simplicidade e seletividade. Os ligantes poliaminas podem ser imobilizados na matriz sólida através dos agentes ativadores CNBr (brometo de cianogênio), epicloridrina, bisoxirano e divinilsulfona, que podem servir ou não como braços espaçadores. O adsorvente deve apresentar o mínimo de desprendimento de ligante e favorecer o baixo impedimento estérico (SOUZA et al., 2010; HOUEN, 2001).
As poliaminas podem ser empregadas em cromatografias de afinidade para a purificação de proteínas que possuam afinidade por seu grupamento amino (HOUEN, 2001). Amino oxidases, lactoferrina, plasminogênio, bilirrubina e proteínas que possuem grupamentos tioésteres são proteínas que apresentam afinidade por grupamentos amino (HOUEN et al., 1996; HOUEN e SVENDSEN, 1998; DEUTSCH e MERTZ, 1970; SHI et al., 2005; VIANELLO et al., 1999).
Os ligantes poliaminas também podem ser utilizados como trocadores de ânions, interagindo com moléculas carregadas negativamente através de interações eletrostáticas (HOUEN, 2001). Zhao e colaboradores (2000) mostraram que o reconhecimento entre as imunoglobulinas E e as poliaminas são principalmente decorridas de interações eletrostáticas.
Dependendo do tamanho da cadeia carbônica da sua estrutura, as poliaminas podem possibilitar interações hidrofóbicas. A presença de um braço espaçador hidrofóbico também auxilia para a ocorrência de interações desse tipo, além de evitar impedimento estérico (HOUEN, 2001). Em alguns casos as poliaminas podem ser utilizadas como braços espaçadores (PERŁA et al., 2004; PITIOT et al., 2001).
Portanto, as poliaminas podem ser utilizadas como ligantes de interação mista, pois possibilitam a ação das interações eletrostáticas, hidrofóbicas e de afinidade. Bresolin e colaboradores (2010, 2011, 2012) mostraram que as aminas TREN (tris-2(aminoetil)amina), ω- aminodecil e ʟ-lisina e poli-ʟ-lisina, utilizadas como ligantes na purificação de IgG por cromatografia negativa.
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2.4.1. ω-Aminohexil (1,6-diaminohexano) como ligante em cromatografia
O ω-aminohexil é uma diamina formada por dois grupos amino (–NH2) e uma cadeia
carbônica contendo seis átomos de carbono (estrutura apresentada na Figura 2.2). Como explicado na seção 2.4, por ser uma poliamina, o ω-aminohexil se apresenta com grande potencial para ser utilizado no processo de purificação de biomoléculas. Sua estrutura apresenta duas aminas, que em determinadas condições, podem se apresentar carregadas positivamente, e apresenta também uma cadeia carbônica, proporcionando caráter hidrofóbico à molécula. Esta alquilamina imobilizada em suportes sólidos pode ser utilizada como ligante em cromatografia de troca iônica ou de interações mistas. Por ser uma alquilamina, o ω-aminohexil apresenta pKa na
faixa de 10 a 11 (KLEIN, 2012; SOLOMONS et al., 2014).
Figura 2.2. Estrutura molecular do ligante ω-aminohexil em pH 7,5 (Fonte: Adaptado de
PERŁA et al., 2004).
Souza e colaboradores (2010) avaliaram o potencial do ω-aminohexil como ligante na purificação de IgG a partir de plasma e soro humano. O estudo avaliou também o efeito de um braço espaçador na adsorção de IgG e resultou que o ligante imobilizado via bisoxirano mostrou- se mais eficiente para a purificação em termos de recuperação de IgG com maior pureza e capacidade dinâmica do que quando imobilizado via CNBr.
2.4.2. PEI (poli(etilenoimina)) como ligante em cromatografia
O poli(etilenoimina) é um polímero de cadeia bastante ramificada. O PEI é sintetizado a partir da polimerização de monômeros de aziridina (etilenoimina), contendo como unidade básica –(–CH2CH2–NH–)n. Como mostrado na Figura 2.3, sua estrutura apresenta muitos grupamentos
amina, sendo uma poliamina com grande potencial catiônico. A proporção entre as aminas primárias, secundárias e terciárias de sua estrutura é de 1:2:1(PETSCH et al., 1998; JONES et al.,
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1944; GODBEY et al., 1999; LUNGWITZ et al., 2005; YU et al., 2013). O PEI apresenta carga positiva em uma ampla faixa de pH, pois o valor de seupKa é de 9,7 (MANZUR et al., 2007).
Figura 2.3. Esquema representativo da polimerização da aziridina para produção do ligante PEI
em pH 7,5 (Fonte: Adaptado de YU et al., 2013).
O PEI já foi amplamente empregado em processos de produção de papel e shampoo, e na purificação de água (GODBEY et al., 1999; KIRCHEIS et al., 2001). Atualmente, sua aplicação vem crescendo na área de purificação de proteínas, mas também na área de terapia gênica (gene
delivery) (GODBEY et al., 1999; LUNGWITZ et al., 2005).
Em processos de separação e purificação de biomoléculas, o PEI vem sendo estudado, por exemplo, na adsorção de ácidos nucléicos (UNSAL et al., 2000) e endotoxinas (HANORA et al., 2005; PETSCH et al., 1998). Nos processos cromatográficos, Gonzalez e colaboradores (2010) verificaram a influência da massa molar média do PEI na adsorção de albumina bovina, indicando que o PEI de massa molecular 60000 Da mostrou melhores resultados na adsorção quando comparado aos PEIs de massas moleculares de 1200 e 423 Da, devido à melhor disposição dos grupos funcionais. Yu e colaboradores (2013) avaliaram a densidade de PEI imobilizado em Sepharose FF na adsorção de albumina bovina, e os resultados mostraram que existe uma faixa de valores de densidade na qual a capacidade de adsorção é ótima, além de o impedimento estérico ser baixo, facilitando o transporte das proteínas. Liu e colaboradores (2014) avaliaram a adsorção de albumina bovina em ligantes PEI modificados com grupos hidrofóbicos benzoíla a partir dos estudos realizados por Yu e colaboradores (2013), e verificaram que o desempenho de adsorção de proteínas para o PEI modificado é independente da densidade de ligantes quando se utiliza PEI não modificado, ou seja, ao utilizar os diferentes ligantes têm-se diferentes condições cromatográficas.
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