Eliane Lazzar
2.5 CARACTERIZAÇÃO QUÍMICA DOS BIO-ÓLEOS
2.5.2 Cromatografia líquida bidimensional abrangente
O elevado poder de separação promovido pelas técnicas multidimensionais de cromatografia liquida é resultado do emprego de dois ou mais sistemas independentes de separação (dimensões).80 Particularmente, na cromatografia líquida bidimensional
(2D LC), uma separação é realizada na primeira dimensão (1D) e posteriormente as
frações do eluente são submetidas a uma separação na segunda dimensão (2D).81
Dependendo da forma com que o eluato da primeira coluna é transferido para a segunda coluna, pode-se classificar a cromatografia liquida bidimensional em off-line e
on-line 2D LC. Na off-line as frações do eluato são coletadas manualmente ou através
de um coletor de frações e, após, são reinjetadas na 2D. Nesse modo de 2D LC, podem-
se empregar sistemas convencionais de LC, no entanto, são necessários longos tempos de análise e tem-se a chance de introduzir erros de reprodutividade aos resultados, devido a maior manipulação da amostra.80 Alternativamente, no modo on-line 2D LC o
efluente da 1D é continuamente e automaticamente injetado na 2D, através de uma
interface adequada, esse modo apresenta menor tempo de análise e maior reprodutibilidade dos resultados, quando comparado ao modo off-line.82
Os sistemas on-line 2D LC são divididos em cromatografia liquida bidimensional
de heart-cutting (LC-LC, do inglês two dimensional heart-cutting liquid chromatography) e cromatografia liquida bidimensional abrangente (LC×LC), dependendo do número de frações provenientes da separação 1D, que são transferidas para a separação na 2D.
No modo heart-cutting apenas frações relevantes do efluente, as quais contenham compostos de interesse, são submetidas à separação na 2D, enquanto que a LC×LC
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permite a separação de toda a amostra em ambas as dimensões.80,83 Um sistema típico
de LC×LC, como pode ser observado na Figura 4, consiste de três seções: (1) 1D -
injetor, bomba e coluna cromatográfica; (2) 2D - bomba de alta pressão, coluna e
detector; (3) Interface.80 A interface, também conhecida como modulador, é considerada
um dos pontos centrais de um sistema de LC×LC, pois permite o acoplamento entre as duas dimensões. A vasta maioria de interfaces empregadas em LC×LC condiz com sistemas de duas válvulas de comutação controladas eletronicamente com mesmas 6, 8, 10 e 12 portas.82,84
Figura 4. Diagrama de um sistema típico de LC×LC destacando a interface, válvula
entre o detector da 1D e a coluna da 2D. A seta azul, entre os esquemas das interfaces,
descreve a alternancia entre a coleta do efluente da 1D e a injeção na coluna da 2D. (Adaptada
de Cacciola et al.80)
Em geral, essas válvulas (Fig. 4) são equipadas com dois loops (alças) de volume interno idêntico e tem como proposta coletar o efluente da 1D, armazenar e
transferir para a coluna da 2D, onde ocorre a segunda separação.82 Neste sentido, o
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que sai da coluna 1 (tempo que a válvula é mantida nessa posição denomina-se período de modulação), a fração no loop 2 é enviada para a separação na coluna 2. Após esta separação, a válvula é então modificada e a fração no loop 1 é transferida para a coluna 2, enquanto a próxima fração é coletada no loop 2. O tempo necessário para a separação na 2D (incluindo gradiente e tempo de reequilibrio) deve ser igual ao período
de modulação.85
Um dos desafios que a técnica de LC×LC apresenta é a otimização das condições do método cromatográfico, a fim de se obter a melhor separação possível.86
Como requisitos em métodos de LC×LC, a separação na 1D deve empregar fluxos de
fase móvel relativamente baixos, uma vez que, o fluxo da 1D juntamente com o período
de modulação é um dos parâmetros que diretamente determinam o volume de fração que será transferido para a 2D, o qual deve ser o mínimo possível. Ao contrário, na 2D
necessita-se o emprego de fluxos elevados de fase móvel, colunas de menores comprimentos e maiores diâmetros internos, para obter uma rápida separação, que deve coincidir com o período de modulação.81
No método de 2D LC procura-se encontrar o maior grau de ortogonalidade e
assim a máxima capacidade de pico. A ortoganilidade refere-se à combinação de mecanismos de retenção que oferecem diferentes seletividades para a separação da amostra, enquanto, que a capacidade de pico descreve o número máximo de compostos separados em uma única coluna analítica.80 Máxima ortogonalidade e capacidade de
pico são encontradas quando todos os componentes da amostra são submetidos a dois diferentes métodos de separação totalmente não correlacionados, entretanto, tais sistemas são raramente encontrados na prática.86
Em geral, o modo de separação mais empregado em 2D LC é a combinação de
duas separações por cromatografia líquida de fase reversa (RPLC x RPLC, do inglês
Reversed Phase Liquid Chromatography). A priori, tal combinação pode parecer não
apresentar diferentes mecanismos de retenção para ser considerada ortogonal, entretanto, uma vez que diferentes grupos funcionais ligantes (C18, fenil, ciano, amino entre outros) e fases móveis, em ambas dimensões, são cuidadosamente selecionados, essa combinação pode oferecer um bom grau de ortogonalidade. Além do mais, a maioria das demais combinações, tais como, cromatografia liquida de fase normal (do inglês Normal Phase Liquid Chromatography) NPLC x RPLC, cromatografia liquida de troca iônica (do inglês Ion Exchange Chromatography) IEC x RPLC, cromatografia de exclusão por tamanho (do inglês Steric Exclusion Chromatography) SEC x RPLC, sofrem problemas de incompatibilidade entre as fases móveis.82,84,86,87,86,88,82
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A ortogonalidade e capacidade de pico para diferentes conjuntos de coluna em análise de compostos presentes em bio-óleo por LC×LC, foram detalhadamente discutidas por Masle et al.18 Os resultados apontam para maior ortogonalidade e
capacidade de pico, com valores de 3,2 e 1002, respectivamente, para a combinação de colunas RPLC x RPLC (hypercarb kinetex na 1D e fenil hexil na 2D). Tomazini et al.19
também empregam a combinação RPLC x RPLC (Ascentis RP-Amide na 1D e Ascentis
Express C8 na 2D) para a separação de amostras de fase aquosa, obtendo 4,7 e 347
para a ortogonalidade e capacidade de pico, respectivamente.
Referente aos detectores, a LC×LC é facilmente combinada com detectores convencionais empregados em LC monodimensional, incluindo o DAD e MS, os quais oferecem informações adicionais dos compostos presentes na amostra. Entretanto, devido a rápida velocidade de análise na 2D, os detectores usados em LC×LC, devem
possuir elevada taxa de aquisição de dados, uma vez que, perdas na resolução podem ser ocasionadas pelo baixo número de dados coletados.83
Embora a separação dos compostos de fase aquosa de bio-óleo tenha sido explorada nos útlimos anos por LC×LC, tais estudos são limitados à caracterização de biomassas lignocelulosicas e à análsise qualitativa. De fato, existem poucos artigos no campo de LC×LC que exploram a quantificação, de pelo menos, parte dos compostos separados.20-25 Dessa forma, é amplamente aceito que novos desenvolvimentos são
necessários para demosntrar as capacidades quantitativas da LC×LC, ainda mais se a análise de rotina for direcionada.26
Na presente tese de doutorado utilizou-se a RPLC×RPLC combinda com o DAD e MS com inonização por eletroespray (ESI, do inglês electrospray ionization), a fim de se obter a máxima informação da composição da amostra, além de desenvolver e validar, pela primeira vez, um método quantitativo para análise da fase aquosa de bio- óleo.