Cromatografias de depleção de Albumina e IgG

Inicialmente, uma alíquota de 500 µ L de plasma de cada mulher participante do estudo foi filtrada em membrana 0,22 µM e, para cada amostra, foram realizadas 3 cromatografias subsequentes, a partir da aplicação de 150 µ L de plasma filtrado à coluna HiTrap Albumin &

IgG Depletion de 1 mL (GE Healthcare - USA) acoplada a um sistema de FPLC ÄKTApurifier 10 (GE Healthcare - USA).

Todas as alíquotas foram analisadas através da medida da absorbância a 216 e 280nm ao longo de todo processo cromatográfico, como representado na Figura 7.

Inicialmente, as amostras de plasma aplicadas à coluna apresentavam uma concentração média de aproximadamente 70 mg/mL, após o processo cromatográfico de depleção as frações isentas de albumina e IgG, que caracterizam o pico não retido (pico 1) ou plasma depletado, apresentaram concentrações médias de cerca de 4 mg/mL, o que demonstra a eficiência da depleção da proteínas abundantes albumina e IgG.

Ao fim das cromatografias de depleção referentes a cada participante do estudo, as frações de plasma depletado foram concentradas à vácuo em Concetrator plus (Eppendorf – DE) para posterior cromatografia em colunas de lectinas vegetais imobilizadas.

Figura 7 – Depleção de albumina e IgG das amostras de plasma humano

Perfil cromatográfico do processo de depleção de albumina e IgG das amostras de plasma humano utilizando coluna HiTrap Albumin & IgG Depletion de 1 mL (GE Healthcare - USA) acoplada a um sistema de FPLC ÄKTApurifier 10 (GE Healthcare - USA). As proteínas que não interagiram com a matriz, ou seja, as proteínas que caracterizam o plasma depletado, foram eluídas com tampão de equilíbrio (Tris-HCl 20 mM, pH 7,4, contendo NaCl 0,15 M) e, para eluição da fração proteica que interagiu com a matriz, ou seja, fração rica em albumina e IgG, foi adicionado tampão Glicina-HCl, 0,1 M pH 2,7 (representado pela linha verde). Todas as alíquotas foram analisadas através da medida da absorbância a 280nm ao longo de todo processo cromatográfico, como ilustrado pela linha azul.

O plasma humano contém de 60 a 80 mg de proteína por mililitro, somadas a outras várias moléculas, que incluem sais, lipídeos, eletrólitos e pequenos metabólitos, como peptídeos e aminoácidos (CHAN et al., 2004).

A caracterização de proteínas séricas, assim como a prospecção de biomarcadores no plasma sanguíneo, é consideravelmente dificultada pelo vasto intervalo dinâmico, ou dynamic

range, do proteoma sérico. Com concentrações de proteína medindo cerca de 12 ordens de

grandeza, a análise por espectrometria de massa convencional permite a detecção de apenas algumas proteínas de baixa abundância. Dessa forma, a depleção prévia de proteínas de alta abundância da amostra pode aumentar consideravelmente a profundidade analítica, tornando- se, portanto, uma prática amplamente utilizada (JAROS et al., 2013).

Existe ainda bastante controvérsia sobre a estratégia de depleção mais adequada para análise proteômica do plasma humano. Devido aos desafios analíticos de mensurar

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precisamente amostras contendo um grande intervalo dinâmico de proteínas em diferentes concentrações, a maioria dos protocolos atuais tem empregado depleção prévia de proteínas altamente abundantes tais como albumina e imunoglobulinas.

Atualmente, kits de depleção para a remoção simultânea de albumina e IgG estão disponíveis comercialmente. A recente tendência na análise proteômica apoia o uso de matrizes de imunoafinidade, que são constituídas de matrizes com anticorpos diferentes covalentemente ligados contra a maioria das proteínas abundantes. Alguns estudos comparativos sobre as várias abordagens de depleção vêm sendo realizados (BELLEI et al., 2011).

Yocum e colaboradores (2005) analisaram soro humano com e sem depleção, por imunoafinidade, de seis proteínas abundantes em massa por cromatografia líquida multidimensional em tandem e espectrometria de massas. Duas replicatas de cada experimento foram realizadas e comparadas umas com as outras. Em ambas replicatas, da amostra depletada e não-depletada, houve uma sobreposição de 73% e 72% de peptídeos identificados e sobreposição de 64% e 78% de proteínas identificadas, respectivamente. Das 262 proteínas únicas identificadas nas quatro corridas, 82 foram encontradas em todas as quatro amostras, 142 exclusivas para o soro depletado e 38 exclusivas para o soro não- depletado. Logo, os autores concluíram que, embora a depleção sérica de proteínas altamente abundantes tenha aumentado significativamente o número de proteínas identificadas, tanto o grau de complexidade da amostra e seu método de depleção resultaram em perda não seletiva de algumas outras proteínas.

Infelizmente, a probabilidade de remoção de algumas proteínas de baixa abundância, juntamente com as moléculas abundantes, é um verdadeiro problema associado com qualquer método de separação de proteínas. A albumina é a proteína mais abundante presente no plasma, mas, ao mesmo tempo, é uma excelente proteína transportadora, ligando-se a vários compostos, incluindo hormônios, lipídeos e aminoácidos. Por este motivo, a remoção da albumina a partir do plasma também pode resultar na perda de alguns peptídeos de baixa abundância ou pequenas proteínas de interesse, tais como citocinas (GRANGER et al., 2005). Proteínas transportadoras, tais como a albumina, atuam como ímãs para acumular e amplificar as proteínas de menor abundância, tais como bilirrubina, funcionando como uma esponja molecular. Portanto, em qualquer ponto, a concentração de uma proteína de baixo peso molecular ou mesmo um peptídeo é em função da sua entrada e saída do sangue e se ela tem afinidade de ligação a uma proteína transportadora. Portanto, se um biomarcador é uma proteína de baixo peso molecular que tem uma elevada afinidade de ligação com uma proteína

transportadora, sua existência é então dependente da sua taxa de produção, taxa de depuração/ excreção e taxa de depuração/excreção da proteína transportadora. Visto que uma proteína transportadora tem uma meia-vida mais longa do que o biomarcador não ligado, a concentração total do biomarcador pode tornar-se elevada devido à sua associação com a proteína transportadora. Esta amplificação pode, em teoria, provocar um aumento de várias ordens de grandeza (YOCUM et al., 2005).