Devido ao fato da natureza dualística dos liquens, questões como o comportamento dos componentes da simbiose em uma situação de isolamento ou se a química dos liquens poderia ser mimetizada em condições de cultivo, são freqüentes alvos de estudo. Nos últimos vinte anos tem aumentado o interesse em estudos de isolamento e cultivo de liquens e seus simbiontes isolados. O principal ponto abordado é em relação à capacidade de produção de moléculas produzidas pela simbiose em um estado axênico (ou seja, puro) de cultura (CRITTENDEN et al., 1995). Outro assunto amplamente estudado é em relação às tentativas de se restabelecer a simbiose a partir dos biontes isolados (STOCKER- WÖRGÖTTER, 2001; HONNEGER, 1991) e desta maneira tentar compreender os mecanismos
envolvidos neste intrigante e ainda desconhecido processo de liquenização.
Entretanto os liquens são organismos que apresentam uma grande dificuldade de isolamento e crescimento, sendo as lentas taxas de crescimento um grande obstáculo para o sucesso destes processos (CRITTENDEN et al., 1995; STOCKER-WÖRGÖTTER, 1995).
Comparando com fungos de vida livre a taxa de crescimento do micobionte é extremamente lenta, e este fator tem sido a principal dificuldade para a investigação fisiológica dos estados axênicos (CRITTENDEN et al., 1995).
Nos últimos 30 anos os trabalhos de isolamento e cultivo realizados por Vernon Ahmadjian (AHMADJIAN, 1967; AHMADJIAN, 1973; AMADJIAN & JACOBS, 1981) estimularam o interesse de outros pesquisadores nesta área promovendo um progresso nestas últimas três décadas na pesquisa com micobiontes, fotobiontes e resíntese de liquens a partir dos biontes isolados (YAMAMOTO et al., 1985; STOCKER-WÖRGÖTTER, 2001; STOCKER-WÖRGÖTTER; 2002). Avanços na área de microbiologia, incluíndo a
disponibilidade de equipamentos laboratoriais mais avançados são outros fatores que estimularam o recente progresso desta área da liquenologia (STOCKER ÖRGÖOTTER,
farmacologicamente ativas faz destes organismos interessantes do ponto de vista biotecnológico. Diversos estudos demonstraram que compostos de liquens, entre metabólitos secundários e polissacarídeos, podem apresentar atividade antimicrobiana (XAVIER-FILHO et al., 1990; YAMAMOTO et al., 1993), anti-micótica (YAMAMOTO et al.,
1993; SHAHI et al., 2001), anti-inflamatória (HIGUCHi, et al., 1993), anti-viral e anti-tumoral (CARNEIRO-LEÃO et al., 1997; STUELP-CAMPELO et al., 2002).
Entretanto, liquens apresentam uma lenta taxa de crescimento, mesmo em seu habitat natural e programas de coleta em larga escala podem colocar em risco a integridade biológica destes organismos. Desta maneira a utilização de cultivo de simbiontes liquênicos, buscando a obtenção de compostos ativos, mostra-se como uma importante ferramenta biotecnológica a ser explorada.
Estudos recentes demonstraram a capacidade dos micobiontes em produzirem metabólitos secundários em culturas axênicas (HAMADA & MIYAGAWA, 1995; STOCKER- WÖRGÖTTER & ELIX, 2002; ROSSO et al., 2003; CORDEIRO et al., 2004). Porém, algumas
destas substâncias produzidas podem diferir daquelas originalmente encontradas no líquen. Alguns autores sugerem a utilização de algum tipo de estresse (temperatura, osmótico, UV) como ativador destas vias metabólicas (HAMADA & MIYAGAWA, 1995; STOCKER- WÖRGÖTTER & ELIX, 2002; SOLHAUG et al., 2002). STOCKER-WÖRGÖTTER e colaboradores (2002), por exemplo, submeteram o micobionte de Lobaria spathulata a baixas temperaturas por duas semanas a cada seis semanas e obtiveram a síntese de compostos secundários, sugerindo que a produção destes metabólicos possa ser uma resposta as condições ambientais a que os liquens estão submetidos.
Outro fator interessante é com relação a possibilidade de se utilizar o cultivo dos simbiontes isolados em processos de ressíntese, tentando assim uma melhor compreensão dos processos de reconhecimento e de interação existentes nesta simbiose (HONNEGER, 1991; AHMADJIAN, 1993). O primeiro processo de ressíntese de liquens data de 1966
(AHJMADJIAN, 1966), desde então diversos estudos envolvendo culturas de ambos
simbiontes foram realizados, entre eles a seletividade do micobionte pelo fotobionte (AHMADJIAN & JACOBS, 1981) e lectinas envolvidas no processo de reconhecimento
Algumas revisões descrevem várias metodologias para o isolamento e cultivo dos simbiontes liquênicos entre elas o uso de: esporos, fragmentos de talo, conídios, sorédios, ultracentrifugação, micropipetas, micromanipuladores, entre outros. Porém, os métodos mais utilizados são a obtenção de colônias através de esporos e fragmentos de talo para micobiontes e micropipetagem e fragmentos de talo para fotobionte (BUBBRICK, 1988;
AHMADJIAN, 1993; CRITTENDEN et al., 1995).
O método de isolamento (figura 2.1) através de esporos tornou-se o mais popular para liquens que apresentam estruturas reprodutivas, e é baseado na obtenção de cultura através da germinação de esporos eliminados pelo apotécio. Muitos esforços foram realizados na tentativa de se obter colônias originadas de esporos únicos, principalmente com o objetivo de se estudar os diferentes quimio-tipos presentes em liquens. Mais recentemente estudos com diversas espécies do gênero Xanthoria, através do crescimento de esporos, demonstrou que Xanthoria parietina trata-se de um líquen homotálico, enquanto que outras cinco espécies apresentam-se como heterotálicos (HONEGGER et al., 2004). Outro método de cultivo utilizando esporos é a obtenção de cultura a partir de esporos múltiplos, a qual apresenta-se mais simples e com melhor desenvolvimento das colônias. A metodologia utilizando esporos apresenta-se como o mais confiável, uma vez que a colônia obtida a partir de esporos apresentaria um risco reduzido de ser um possível contaminante (AHMADJIAN, 1993, 1973, BUBBRICK, 1988, STOCKER-WORGOTTER, 1995,
CRITTENDEN et al., 1995).
A metodologia de fragmento de talo é muito utilizada para liquens estéreis, ou seja, que não apresentam a formação de apotécio ou esporos (figura 2.2). Este método foi descrito por YAMAMOTO (1985), como uma modificação do método de cultivo de tecidos vegetais, comumente utilizado para plantas. Embora este método seja amplamente utilizado atualmente, foi primeiramente rejeitado devido às altas taxas de contaminação e a incerteza de purificação do micobionte correto com o método. A modernização dos métodos de microbiologia, como utilização de bancadas de fluxo laminar, e novas técnicas de biologia molecular para identificação das espécies tornam este método relativamente rápido (quando
FIGURA 2.1:METODOLOGIA DE ISOLAMENTO DE MICOBIONTE