O gênero Bacillus pertencente à família Bacillaceae, é extremamente heterogêneo, tanto geneticamente quanto fenotipicamente (tipo respiratório, metabolismo dos açúcares, composição da parede, dentre outros).
As espécies do gênero Bacillus são bastonetes com extremidades retas ou arredondadas de tamanhos variáveis (0,5x1,2 µm até 2,5x10 µm), esporulados, Gram positivos ou Gram variáveis (coloração de Gram não é positiva nos cultivos jovens). O cultivo destes microrganismos pode ser difícil, visto que algumas espécies podem exigir inúmeros fatores de crescimento, aspecto colonial no ágar são variáveis e o fenômeno de dissociação são frequentes (GOMES, 2013).
Ainda seguindo o tópico de Gomes (2013), as espécies do gênero Bacillus esporulam logo que as condições não são favoráveis (um só esporo por célula vegetativa); frequentemente são muitos resistentes no meio ambiente. O fenômeno de esporulação ao contrário do que acontece com outros gêneros, não é inibido pelo oxigênio. A esporulação depende das condições de cultivo “in vitro”. Algumas espécies não esporulam em meios especiais. Certas espécies do gênero Bacillus produzem esporos que são hidrófobos, ou seja, aderem fortemente a diversos materiais, resistindo aos procedimentos de limpeza.
3.3.1 Elaboração dos meios de cultura
Os meios de culturas são formulações complexas adequadas e adaptados ao tipo de bactéria, para permitir o crescimento bacteriano em laboratório. Quanto ao estado físico podem ser líquidos, sólidos ou semissólidos. Neste caso mais específico utilizou-se o meio sólido com ágar para fazer culturas puras da bactéria liofilizada e após o crescimento bacteriano, foi feita cultura em meio líquido. O objetivo da elaboração dos meios de cultura é fazer crescer a bactéria em perfeitas condições vegetativas sendo neste caso específico um meio de cultura seletivo, pois a bactéria é alcalifílica.
3.3.2 Bacillus sphaericus 2
A primeira bactéria utilizada foi a Bacillus sphaericus da coleção belga LMG 22257, cujas principais características são: Gram positiva, alcalifílica obrigatória, aeróbia, formadora de esporos ovais (DAVIDSON, 1988).
Por ter característica alcalifílica, há uma vantagem na sobrevivência da bactéria nas matrizes cimentícia, cujo pH é perto de 13. Por ter natureza aeróbia, o oxigênio que se encontra nas matrizes é favorável a permanência do Bacillus (MARTINS, 2015). Esse conjunto de aspectos foi determinante para a escolha da bactéria a ser utilizada nesse trabalho.
O Bacillus sphaericus (LMG 22257) tem a cultura “overnight ” (+/- 18h). A largura das células vegetativas varia entre os 0,6 e 0,7mm e são observados esporos esféricos que deformam o bacilo (Figura 15). Para determinar se o gram do Bacillus
sphaericus é positivo, indicando que não houve contaminação com uma gram
negativa, se fez necessário o teste de coloração. O teste foi realizado fixando as células previamente em uma lâmina de microscópio, em seguida foram tingidas com violeta de Genciana, lavando-as com água, cobrindo-as com lugol e finalmente submetendo-as a lavagem com álcool 95o. A dimensão das colônias após 24 horas de gram varia entre 1 a 5 mm e o seu diâmetro é aproximadamente 1,5 mm.
Figura 15 - Fotografia dos esporos do Bacillus sphaericus utilizando o microscópio óptico da marca Olympus, modelo BX-60M
2 Essa etapa foi realizada com apoio da pesquisadora Marcia Shirakawa do Laboratório de Microestrutura e Ecoeficiência da Universidade de São Paulo (LME-USP) que, gentilmente, cedeu a cepa de bactérias. O cultivo e manejo das bactérias na UTFPR foi realizado pela professora do departamento de Química e responsável pelo Laboratório de Biotecnologia e Microbiologia Giselle Maria Maciel.
Caso a coloração observada no microscópio óptico seja azul-violeta então ela é de fato gram positiva, caso a coloração seja vermelha, trata-se de uma colônia de gram negativa, conforme mostrado na Figura 16.
(a) Gram positiva (b) Gram negativa
Figura 16 - Método de coloração de gram para diferenciar espécies bacterianas Fonte: http://laboratoryinfo.com/gram-staining-principle-procedure-interpretation-and- animation/ (2017).
Seguiu-se a metodologia proposta por Shirakawa et al. (2011) para a elaboração dos meios de cultura, com objetivo de desenvolver a bactéria em condições vegetativas adequadas. Utilizou-se um meio sólido com ágar para fazer culturas puras da bactéria. Após o crescimento bacteriano foi preparada a cultura em meio líquido.
Para a preparação do meio de cultura bacteriano, foi escolhido o B4 modificado, proposto por Zamarreño et al. (2009), contendo como mineral precursor o Ca(C2H3O2)2, diferentemente da grande parte dos estudos realizados, que utilizam na sua maioria o CaCl2. Os meios de cultura devem ser autoclavados a 121°C por 20 min.
As concentrações introduzidas no meio de cultura utilizado nesse trabalho estão de acordo com a Tabela 2.
Tabela 2 - Componentes do meio de cultura B4 modificado para B. sphaericus
Reagente Quantidade (g/L)
Ca(C2H3O2)2 (Acetato de cálcio) 5
Extrato de levedura 20
Ureia 10
Glicose 1
Para verificação da atividade na precipitação de carbonato de cálcio, uma pequena amostra de bactérias foi colocada no meio de cultura, como mostrado na Figura 17.
Figura 17 - Precipitação da bactéria Bacillus sphaericus com nutrientes no meio B4
Após o preparo do meio de cultura B4 modificado, os corpos de prova de argamassa foram colocados em um recipiente preenchido com o inóculo bacteriano e o meio de nutrientes por um período de 7 dias para incorporação dos microrganismos nas matrizes cimentícias.
3.3.3 Bacillus subtilis
O Bacillus subtilis é uma bactéria ureolítica, anaeróbia, formadora de esporos, gram positiva, de formato bastonete cilíndrico com diâmetro entre 2 e 4 mm (MAZZA, 1994). O Bacillus subtilis utiliza a uréia como fonte de energia e produz amônia quando existe aumento do pH no ambiente. O pH alcalino é o requisito primário para a precipitação de calcita. De acordo com Rao et al. (2013), no Bacillus subtilis o acetato de cálcio tem produzido cristais de calcita esféricos enquanto que o CaCl2 quando utilizado como mineral precursor, deriva cristais de calcita romboédricos. Quanto maior a precipitação de cristais de CaCO3, obviamente melhor o processo de biocalcificação das matrizes cimentícias. A concentração de bactéria, uréia e Ca2+ é determinante na quantidade do produto precipitado.
Jönk et al. (2014) estudaram um meio de cultura para o máximo crescimento celular. o experimento mostrou que a concentração de peptona, extrato de carne, extrato de levedura, concentração de NaCl e a influência da agitação são estatisticamente significativos, fatores estes que intensificaram o crescimento do
Bacillus subtilis. Observaram também que as interações entre agitação e quantidade
de proteínas, bem como a agitação e temperatura geram efeito positivo. As interações entre temperatura e os parâmetros concentração de NaCl e extrato de levedura possuem efeito negativo.
Para o Bacillus subtilis também foi seguida a metodologia proposta por Shirakawa et al. (2011) para a elaboração dos meios de cultura, com objetivo de desenvolver a bactéria em condições vegetativas adequadas. Utilizou-se um meio sólido com ágar para fazer culturas puras da bactéria. Após o crescimento bacteriano foi preparada a cultura em meio líquido. A concentração de bactérias utilizada para o meio precursor foi de 105 bactérias/mL de solução, seguindo o número ótimo de trabalhos anteriores de outros autores.
Para a preparação do meio de cultura bacteriano, foi escolhido o B4 modificado, proposto por Zamarreño et al. (2009), contendo como mineral precursor o Ca(C2H3O2)2 . Os meios de cultura foram ser autoclavados a 121°C por 20 min.
As concentrações introduzidas no meio de cultura utilizado nesse trabalho
3 Essa etapa foi realizada com apoio da professora e pesquisadora Giselle Maria Maciel do Laboratório de Biotecnologia e Microbiologia da Universidade Tecnológica Federal do Paraná (DAQBi- UTFPR) que, gentilmente, cedeu a cepa de bactérias e auxiliou no manuseio.
estão de acordo com a Tabela 3. Alguns trabalhos utilizaram peptona, extrato de carne e NaCl como nutrição, mas foi decido manter o meio de cultura utilizado por Shirakawa
et al. (2011) para a Bacillus sphaericus em seu trabalho para avaliar a reação sobre a Bacillus subtilis.
Tabela 3 - Componentes do meio de cultura B4 modificado para Bacillus subtilis
Parâmetro Quantidade (g/L)
Ca(C2H3O2)2 (Acetato de cálcio) 5
Extrato de levedura 20
Ureia 10
Glicose 1
Tendo finalizado o preparo do meio de cultura B4 modificado, as amostras foram colocadas em um recipiente preenchido com o inóculo bacteriano no período de 7 dias para incorporação dos microrganismos nas matrizes cimentícias.