das e funcionais, de maneira que facilite o deslocamento de pessoal e material, de modo unidirecional.
As áreas de lavagem e esterilização, de pre- paração de meio de cultura e de almoxari- fado devem ser compartimentalizadas. Por sua vez, as áreas para inoculações e trans- ferências devem ser, preferencialmente, separadas das demais e com a menor cir- culação de pessoas possível, evitando-se a contaminação por agentes externos (Tom- bolato; Costa, 1998).
Nesse contexto, as instalações básicas de um laboratório de cultura de tecido vegetal de- vem contemplar a seguinte infraestrutura: • Sala de expurgo – Nesse recinto, podem-
se fazer dois tipos de limpeza (Figura 2): a pré-limpeza, na qual são eliminadas a sujidade e as impurezas visíveis a olho nu dos exemplares vegetais a serem tra- balhados; e a limpeza final, na qual são retiradas da vidraria as substâncias inde- sejáveis provenientes das salas de pre- paro de meio de cultura, crescimento e climatização.
• Sala de lavagem e esterilização – Essa dependência é destinada a limpar o ma- terial laboratorial por ação de líquidos, especialmente a água, com mistura ou não de produto detergente, bem como a eliminar microrganismos patogênicos. Dada sua função específica, deve ser equipada com autoclave (Figura 3), des- tilador, bidestilador, deionizador e estufa de secagem de material.
Figura 2. Sala de expurgo.
Figura 3. Sala de esterilização.
• Sala de preparo de meio de cultura – Na sala de preparo e estoque dos meios de cultura (Figura 4), deve ser controlada a qualidade destes, de forma a certificar-se de que foram perfeitamente esteriliza- dos em conformidade com as exigências legais. Após 7 dias, deve-se realizar nessa etapa a checagem individual do material que será manipulado dentro da sala de transferência, verificando-se a incidência visual de fungos e bactérias. Essa sala é equipada com agitador magnético, ba- lança analítica, balança eletrônica, con- gelador, fogão, forno de micro-ondas, geladeira e peagâmetro.
• Sala de cultura – Essa dependência é denominada também de sala de trans-
Foto: Magda Celeste Álvares Gonçalves
ferência ou de subcultivo, onde as plan- tas desenvolvidas em meio de cultura são subdivididas em pequenos peda- ços e transferidas para novos meios de cultura, processo este denominado de clonagem. Portanto, esse é um procedi- mento de micromultiplicação vegetativa ou assexuada em grande escala, no qual se estimulam a brotação lateral e o cres- cimento de ramos e raízes, acelerando assim o processo de propagação. Esse ambiente é equipado com central de ar condicionado e câmara de fluxo laminar (Figuras 5A e 5B).
Figura 4. Sala de preparo e estoque dos meios de
cultura.
Figura 5. Sala de cultura (A); e câmara de fluxo laminar (B).
• Sala de crescimento – Nessa sala, podem ser mantidos milhares de explantes por meio de um conjunto de equipamen- tos empregados para permitir o cresci- mento inicial dos meristemas colocados em meio de cultura, no interior de um recinto fechado sob condições ideais controladas de temperatura, fotoperío- do (alternância de períodos de maior e menor luminosidade), intensidade lumi- nosa e umidade, de forma a potenciali- zar a propagação da carga genética da espécie escolhida. Esse ambiente deter- mina o uso de filtros de ar, central de ar condicionado, lâmpadas fluorescentes luz do dia, prateleiras e timer (Figura 6). Também são utilizados biorreatores, pe- quenas caixas de acrílico supridas com nutrientes, vitaminas e hormônios para conseguir um crescimento dos explantes em tempo relativamente menor.
• Estufa de climatização – Nesse comparti- mento (Figuras 7A e 7B) podem ser man- tidos milhares de plântulas por meio de um conjunto de equipamentos capazes de criar condições favoráveis de tempe- ratura, luz e umidade necessárias ao de-
A B
Foto: Magda Celeste Álvares Gonçalves
estoque. Tais cuidados são necessários para se garantir um local próprio em condições de armazenamento e controle do crescimento das espécies, asseguran- do-lhes desenvolvimento e preservação adequados.
• Sala de pesquisador – Ambiente provido de central de ar condicionado, armário, escrivaninha, computador e internet, de forma a favorecer a elaboração de proje- tos, a análise de dados e o tratamento de dados de pesquisa para publicação. Esse espaço é fundamental para se garantir a produção de documentos e relatórios de pesquisa para divulgação em nível local, nacional e internacional. Além dos recursos mencionados, há necessidade de acervos pertinentes necessários para a fundamentação teórica da produção científica.
• Vidraria e reagentes – Os recursos de vidraria e reagentes são fundamentais para que se tenham os recursos míni- mos, dando, assim, suporte para os estu- dos, produção e pesquisas necessárias. Figura 6. Explantes mantidos em sala de crescimento
sob condições de luz, de temperatura e de umidade controlada.
senvolvimento de cada espécie vegetal, independentes da atmosfera exterior. Esse recinto dispõe de ambiente monito- rado com controladores de temperatura, de luz e de umidade, acoplados à câmara de nebulização, à câmara úmida, à irriga- ção por microaspersão, determinando o padrão da qualidade das plantas, como o enraizamento vigoroso, o número, o por- te e as dimensões das flores.
• Almoxarifado – É a sala destinada ao de- pósito dos materiais necessários ao aten- dimento das diferentes instalações bási- cas de um laboratório de cultura de teci- dos. Esse compartimento deve ser provi- do de prateleiras, armários, escrivaninha dentre outros recursos para controle de
Figura 7. Estufas de climatização: estufa coberta com filme de polietileno transparente aditivado, contra radia-
ção ultravioleta e fechada, lateralmente, com tela branca de náilon (A); estufa com irrigação por nebulização para controle da temperatura (B).
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• Vidraria – Baquetas de vidro, balões volu- métricos, béqueres, erlenmeyers, frascos diversos, funis, provetas, pipetas, placas de petri e tubos de ensaio. O cumpri- mento das boas normas de esterilização e higiene desses instrumentos possibili- tará o êxito do trabalho e da produção com segurança, bem como a qualidade da produção.
• Reagentes – Ácido clorídrico ou sulfúrico, álcool comercial 96° ou 98°, ágar, gelrite ou phytagel, hidróxido de sódio ou de potássio, hipoclorito de sódio (água sani- tária comercial) ou hipoclorito de cálcio (HTH usado em piscinas), hormônios e reguladores de crescimento (AIA, ANA, AIB, 2,4-D, 6-BAP, KIN, GA3 e Zeatina), sais que contêm macronutrientes nitrogênio (N), fósforo (P), potássio (K), enxofre (S), cálcio (Ca), magnésio (Mg) e ferro (Fe); N e S e micronutrientes manganês (Mn), zinco (Zn), boro (B), cobre (Cu), cloro (Cl), molibdênio (Mo), cobalto (Co) e iodo (I); sacarose, glicose ou açúcar-cristal de ori- gem comercial, vitaminas (tiamina, piri- doxina, ácido nicotínico, mio-inositol, gli- cina) e soluções tampão para aferimento de peagâmetro.
• Armazenamento de água – A água utili- zada na preparação dos meios de cultura deve ser destilada e deionizada, e arma- zenada em recipientes de vidro ou de plástico de boa qualidade.
• Instrumental – Agulhas, bandejas, bistu- ris (cabos e lâminas), carrinho para trans- porte de material, cestos de arame para autoclavagem, de vidraria e tubos de en- saio, estiletes, lamparinas, pinças, picetas e tesouras.
• Outros materiais – Além dos materiais anteriormente mencionados, outros
poderão ser utilizados, sempre para ga- rantir a qualidade, entre eles o algodão, esfagno, faixas de polipropileno, fibra de coco curtida, filme plástico transparente, fita adesiva, fita-crepe, papel-filtro, papel Kraft, pulverizador manual e vermiculita.
Fases da micropropagação
O desenvolvimento de etapas sucessivas é necessário para se obter mudas provenien- tes de cultura de tecidos. Em razão de cada espécie, essas etapas podem ser:• Manutenção de plantas-matrizes. • Coleta do material vegetal. • Esterilização de explantes. • Inoculação.
• Germinação.
• Regeneração da plântula (ou parte dela). • Multiplicação.
• Alongamento. • Enraizamento. • Aclimatização.
Explantes
Os explantes são secções de folhas, flo- res (pétalas, anteras), sementes (embriões imaturos), raízes, rizomas e mesmo dos meristemas apicais ou laterais das plantas, constituindo-se nos principais pontos de coleta de material vegetal para se iniciar o processo de multiplicação in vitro que dará origem a novas plântulas. A redução do ta- manho dos explantes é muito próxima do
ponto de crescimento primário denomina- do de meristema.
Outro domínio da técnica está no repique, o qual consiste no corte e no transplante dos novos ramos da espécie demandada, dando origem a milhares de plantas ge- neticamente iguais. Entretanto, deve-se considerar que algumas espécies com base genética estável podem ser multiplicadas indefinidamente, enquanto outras apre- sentam limite, em decorrência de proble- mas de mutação.