Culturas simples de linfócitos

Para cultura simples, os linfócitos de animais não diabéticos de 30 semanas eram submetidos ao estímulo com ConA (Sigma) na presença do

extrato aquoso liofilizado das folhas de Passiflora alata (EAL) ou dos

compostos catequina e rutina, isoladamente. Os controles negativos (linfócitos não estimulados por ConA na ausência de extrato aquoso/compostos) e controles positivos (linfócitos estimulados por ConA na ausência de extrato aquoso/compostos) eram adicionados nas culturas.

3.4.1.1. Determinação da concentração de ConA para proliferação de linfócitos em cultura

Para determinação da concentração adequada de ConA a ser adicionada aos linfócitos nos ensaios de cultura simples, eram realizados ensaios de proliferação de linfócitos para estabelecer curva dose resposta. Os linfócitos obtidos eram contados, lavados com PBS 1M e 106 de linfócitos eram marcados por 10 minutos com 1,25 µM de sonda Succinimidil ester de carboxifluoresceína (CFSE) (Biolegend, San Diego, Califórnia, EUA) diluída em PBS 1M. A sonda CFSE determinava a proliferação dos linfócitos pela perda da intensidade de fluorescência a cada divisão celular. Após serem ressuspenssos em meio de cultura RPMI 11mM de glicose e 10%SFB, os linfócitos eram

adicionados na concentração de 2,5x105 em cada poço e em seguida era adicionada a Con A nas concentrações 1, 2, 3, 4, 5 ou 10 µg/mL. O ensaio era realizado em triplicata.

Após 96 horas em meio de cultura, os linfócitos eram lavados com PBS 1 M, centrifugados por 5 minutos 400 × g e fixados em solução de PBS 1 M + 1% formaldeído para posterior aquisição das amostras por citômetro de fluxo Guava Easycyte (Millipore) e análise da proliferação dos linfócitos em diferentes concentrações de ConA pelo software InCyte Guava easycyte (Millipore).

3.4.1.2. Proliferação celular em cultura linfocitária com EAL e polifenóis

Nos ensaios de proliferação celular eram adicionados aos poços 2,5x105 de linfócitos marcados com sonda CFSE (Biolegend) sem adição de estímulo e com adição de estímulo de 5 µg/mL de ConA, respectivamente definidos como controle negativo e positivo. Além disso, eram acrescentadas, em linfócitos estimulados por ConA, diferentes concentrações de: EAL: 50, 100, 300, 400, 500, 800 e 1000 μg/mL; catequina (Sigma): 10, 50, 75, 100 e 500 μM; rutina

(Sigma): 100, 200, 300 e 500 μM.

Após 96 horas em cultura, os linfócitos eram lavados em PBS 1 M, centrifugados por 5 minutos 400 × g e fixados em solução de PBS 1 M formaldeído 1% para posterior aquisição das amostras em citômetro de fluxo (Guava easycyte) e análise da proliferação dos linfócitos pelo software InCyte (Guava easycyte).

3.4.1.3. Determinação da concentração referente ao EC50 de EAL e polifenóis isolados

Após os ensaios de cultura de linfócitos submetidos ao tratamento com EAL ou compostos fenólicos na avaliação de inibição de proliferação, era determinada, para cada tratamento, a concentração que inibia a proliferação de linfócitos estimulados com ConA em aproximadamente 50% em comparação ao grupo controle ConA (sem tratamento). Essa concentração era definida, então, como EC50.

3.4.1.4. Avaliação da proliferação de linfócitos CD4+ e CD8+ provenientes

de cultura tratada com EAL e polifenóis

O mesmo ensaio mencionado acima era realizado utilizando as concentrações de 50, 300 e 500 µg/mL de EAL; 25, 200 e 500 µM de catequina e 100, 300 e 500 µM de rutina.

Após o período de cultura, os linfócitos eram lavados com PBS 1M e centrifugados por 5 minutos (400 × g). Para determinação das populações de linfócitos TCD4 e TCD8, os linfócitos eram marcados com os anticorpos PerCP ou APC anti-camundongo CD4+ e CD8+ (Biolegend) na concentração de 0,25 μg/2,5x105

de linfócitos em 100µL de tampão de marcação. Os linfócitos eram novamente lavados com PBS 1 M, centrifugados nas mesmas condições acima, fixados em PBS 1 M formaldeído 1% e mantidos sob refrigeração (8°C) para posterior aquisição das amostras em citômetro de fluxo (Guava easycyte)

e análise da proliferação dos linfócitos pelo software InCyte Guava easycyte (Millipore).

3.4.1.5. Morte de linfócitos provenientes de cultura tratada com EAL e polifenóis

Linfócitos estimulados por ConA eram submetidos às concentrações de 50, 300, 450 e 500 µg/mL de EAL e EC50 dos compostos. Controles negativos e positivos de proliferação celular eram também adicionados às culturas que eram mantidas por 96 horas em estufa de CO2 a 37°C.

Após este período de tempo, os linfócitos eram lavados com PBS 1 M, centrifugados por 5 minutos, 400 × g e utilizados os marcadores Anexina e 7AAD, segundo as condições do Kit FITC Annexin V apoptosis Detection with 7-AAD (Biolegend), para identificação de linfócitos em apoptose/necrose.

Após 15 minutos de marcação em tampão de cálcio, utilizando-se, por amostra, 100 µL tampão e 5 µL de cada marcador por amostra, os linfócitos eram lavados com PBS 1 M, centrifugados (400 × g) e diluídos em tampão de cálcio (400µL) para serem imediatamente submetidos à leitura por citômetro de fluxo (Guava easycyte) e posterior análise de morte celular dos linfócitos pelo software InCyte (Guava easycyte).

3.4.1.6. Avaliação da morte de linfócitos CD4+ e CD8+ provenientes de

cultura tratada com EAL e polifenóis isolados

As culturas eram realizadas seguindo as mesmas condições descritas acima, adicionando EAL nas concentrações 50, 300 e 500 µg/mL; catequina 25, 200 e 500 µM e rutina 100, 300 e 500 µM. Após o período de cultura, os linfócitos eram lavados com PBS 1 M e as populações CD4+ e CD8+ eram identificadas pela marcação PE ou APC anti-camundongo CD4+ e CD8+ (Biolegend) na concentração de 0,25 μg/2,5x105 de linfócitos por 15 minutos. Os linfócitos eram novamente lavados com PBS 1 M e então submetidos à marcação de anexina e 7AAD, seguindo as recomendações estabelecidas pelo Kit FITC Annexin V apoptosis Detection with 7-AAD (Biolegend) e descritas no tópico anterior. Após a marcação, os linfócitos eram imediatamente analisadas em citômetro de fluxo Guava easycyte (Millipore) e analisadas pelo software InCyte Guava easycyte (Millipore).

3.4.1.7. Avaliação do ciclo celular de linfócitos após tratamento em cultura EAL e polifenóis

O efeito da dose do EC50 de EAL e polifenóis no ciclo celular era avaliado pelo Kit Guava Cell Cycle Reagent (Millipore). Controles de linfócitos e linfócitos na presença do EC50 de cada tratamento foram submetidos à cultura nas mesmas condições dos procedimentos anteriores. Após a cultura, os linfócitos eram lavados com PBS 1M e colocados em placa de 96 poços específica para centrifugação (2 × 105 de linfócitos por poço), onde eram

centrifugados a 400 × g por 5 minutos, lavados com PBS 1M novamente, centrifugados e fixados em solução de etanol 70% gelado por 12 horas a 4°C. Após este período, os linfócitos eram novamente lavados com PBS 1M, centrifugados e, então, incubados com 200 μL de Guava Cell Cycle Reagent (Millipore) por 30 minutos no escuro em temperatura ambiente,

A aquisição das amostras era feita imediatamente pelo citômetro de fluxo Guava easyCyte (Millipore) e analisada por meio do software Guava CellCycle (Millipore).

3.4.2. Culturas mistas de linfócitos com células MIN6 ou ilhotas