Curva de Produção de Citrinina pelos Fungos P citrinum , P expansum

Através de CCD em sílica-gel foi verificada a produção de citrinina pelas

linhagens de

P. citrinum

e

P. expansum

GF, durante todo o período de

incubação (40 dias), em caldo extrato de levedura (YES), em condições estáticas de incubação (Figura 6). O fungo

P. citrinum

foi capaz de produzir citrinina em ambas as condições de incubação, estática e agitação rotacional (Figuras 6 e 7), enquanto o fungo

P. expansum

GF apenas produziu citrinina em condições estáticas. Já os fungos

P. expansum

VIC e

P. roqueforti

não produziram citrinina em meio YES, no período analisado, em ambas as condições de incubação (estática e sob agitação).

9 dias 12 dias 15 dias 18 dias 21 dias 24 dias 40 dias

a b c d e a b c d e a b c d e a b c d e a b c d e a b c d e a b c d e

Figura 6. Representação gráfica da produção de citrinina por linhagens de

Penicillium

spp. por CCD em sílica-gel. Cromatogramas: a)

P.

citrinum,

b)

P. expansum

GF, c)

P. expansum

VIC, d)

P. roqueforti

e

e) citrinina padrão. Os fungos foram crescidos em caldo extrato de

levedura, em condições estáticas de incubação, no escuro, a 25°C, no período de 9, 12, 15, 18, 21, 24 e 40 dias. Alíquotas de 100 µL de extrato de cada cultura e 10 µL de padrão de citrinina - SIGMA,

500 µg mL-1, foram aplicadas no sistema de solvente:

clorofórmio:metanol:água (65:25:4), com Rf de 0,5.

9 dias 12 dias 15 dias 18 dias 21 dias 24 dias 40 dias

a b c d e a b c d e a b c d e a b c d e a b c d e a b c d e a b c d e

Figura 7. Representação gráfica da produção de citrinina por linhagens de

Penicillium

spp. por CCD em sílica-gel. Cromatogramas: a)

P.

citrinum,

b)

P. expansum

GF, c)

P. expansum

VIC, d)

P. roqueforti

e

e) citrinina padrão. Os fungos foram crescidos em caldo extrato de

levedura, sob agitação rotacional (150 rpm), no escuro, a 25°C, no período de 9, 12, 15, 18, 21, 24 e 40 dias. Alíquotas de 100 µL de extrato de cada cultura e 10 µL de padrão de citrinina – SIGMA,

500 µg mL-1_{, foram aplicadas no sistema de solvente:}

De acordo com MIDIO e MARTINS (2000), fatores intrínsecos e extrínsecos podem afetar a produção de micotoxina, devido ao fato de muitas espécies de fungos produzirem tipos particulares de micotoxinas somente em condiç ões ambientais favoráveis.

Os resultados de CCD em sílica-gel foram confirmados por CLAE em fase reversa, onde a citrinina obteve tempo de retenção próximo de 10 minutos. Foi verificada a produção de citrinina durante todo o período de incubação (9o ao 40o dias) dos fungos

P. citrinum

e

P. expansum

GF, quando ambos foram incubados em condições estáticas, no escuro, a 25°C (Figuras 8 e 9).

A massa micelial não influencia a produção de citrinina por

P. citrinum,

tanto em condição estática quanto sob agitação rotacional (Figuras 9 e 10).

A análise quantitativa de citrinina por CLAE em fase reversa mostrou produção crescente de citrinina por

P. citrinum

durante o período do 9o ao 21o dia em ambas as condições de incubação, estática e agitação rotacional (Figuras 9 e 10). Da mesma forma, DAVIS et al. (1975), estudando produção de citrinina por

P. citrinum,

em condições estáticas, observaram início de produção no 8° dia e

produção máxima no 21° dia. Após esse período de tempo, a produção de citrinina decaiu rapidamente. No entanto, RODIG et al. (1966) observaram aumento na produção de citrinina após 21 dias de incubação. VAIL e HOMMAN (1990) detectaram produção de citrinina após 20 horas de incubação e um aumento drástico quando a cultura entrou em fase de crescimento estacionário, indicando que a biossíntese de citrinina está realmente associada com o metabolismo secundário. Ao contrário de

P. citrinum, P. expansum

GF produziu 1,61 µg mL-1 de citrinina no 9° dia, diminuindo sua produção ao longo do tempo, acompanhada por diminuição de biomassa (Figura 8). Esses resultados diferem dos observados por FRANCO et al. (1997), em que os valores

máximos da produção de citrinina por ambos,

P. citrinum

e

P. expansum,

crescidos em meio YES, em condições estáticas de incubação, foram detectados entre o 12° e 14° dia, com decréscimo desta em seguida. Por sua vez, em agitação rotacional a 150 rpm, o fungo

P. expansum

GF, não produziu citrinina em nenhum dos dias de incubação (Figura 11).

0 1 2 3 4 5 6 0 3 6 9 12 15 18 21 24 27 30 33 36 39 42 Tempo (dias) citrinina (µg mL -1 ) 0 0,2 0,4 0,6 massa micelial (g 25 mL -1 )

Figura 8. Produção de citrinina (−−

••

−−) e crescimento de

P. expansum GF

(−−gg−−) em caldo extrato de levedura (YES), em condições estáticas, a 25°C, no escuro, durante 40 dias.

0 1 2 3 4 5 6 0 3 6 9 12 15 18 21 24 27 30 33 36 39 42 Tempo (dias) citrinina (µg mL -1 ) 0 0,2 0,4 0,6 massa micelial (g 25 mL -1 )

Figura 9. Produção de citrinina (−−

••

−−) e crescimento de

P. citrinum

(−−gg−−) em caldo extrato de levedura (YES), em condições estáticas, a 25°C, no escuro, durante 40 dias.

0 1 2 3 4 5 6 0 3 6 9 12 15 18 21 24 27 30 33 36 39 42 Tempo (dias) citrinina (µg mL -1 ) 0 0,2 0,4 0,6 massa micelial (g 25 mL -1 )

Figura 10. Produção de citrinina (−−

••

−−) e crescimento de

P. citrinum

(−−gg−−) em caldo extrato de levedura (YES), em condições de agitação a150 rpm, a 25°C, no escuro, durante 40 dias.

0 1 2 3 4 5 6 0 3 6 9 12 15 18 21 24 27 30 33 36 39 42 Tempo (dias) citrinina (µg mL -1 ) 0 0,2 0,4 0,6 massa micelial (g 25 mL -1 )

Figura 11. Produção de citrinina (−−

••

−−) e crescimento de

P. expansum GF

(−−gg−−) em caldo extrato de levedura (YES), em condições de agitação, a 25°C, no escuro, durante 40 dias.

A produção máxima de citrinina por

P. citrinum

sob agitação rotacional, 1,81 µg mL-1, foi menor se comparada às condições estáticas, que foi de 2,24 µg mL-1. Ao contrário, BLANC et al. (1995), ao avaliarem a produção de citrinina em linhagens de

Monascus ruber

, observaram produção de 59 mg L-1 em meio contendo etanol e 380 mg L-1 _{em fermentador em condições estáticas}

de incubação. HAJJAJ et al. (1999), também estudando

Monascus ruber,

observaram que o aumento da oxigenação, tanto por aumento da aeração, quanto da agitação, é essencial para a produção de metabólitos secundários.

De acordo com BETINA (1984), os metabólitos e as enzimas produzidas

por

Penicillium

e outros gêneros relacionados estão ausentes em culturas

jovens, ou seja, na trofofase, e somente passam a ser produzidos quando a cultura atinge a fase de crescimento estacionário ou a idiofase. Durante este período, alguns nutrientes essenciais tornam-se limitados e, dessa forma, ocorre um drástico aumento de metabólitos secundários, produto final que se acumula em algumas condições de cultivo. Porém, existem casos nos quais algumas espécies de

Penicillium

, como,

Penicillium citrinum,

apresentam produção bifásica de citrinina, ou seja, ocorrendo tanto na fase exponencial quanto na fase estacionária de crescimento do fungo. Além disso, mudanças na composição do meio, pH, temperatura e taxa de aeração podem afetar não apenas a quantidade relativa de metabólitos, mas o tempo de seu aparecimento.

CIEGLER et al. (1977) observaram, em condições estáticas de incubação do fungo

P. expansum

, diminuição da citrinina a partir do 9° e concluíram que esse decréscimo não representou necessariamente degradação de citrinina, mas pode ter sido devido à reação química da citrinina com o substrato. No entanto, DAMOGLOU et al. (1984) relatam que a degradação de citrinina pode ser devida à liberação de enzimas durante a lise celular ou outro tipo de degradação.

Curvas de crescimento fúngico e produção de micotoxina podem variar marcadamente entre diferentes linhagens e sistemas de cultivo, com

crescimento e produção de toxina, sendo altamente regulados em cada

5.3. Produção de poligalacturonases e xilanases, simultaneamente à

No documento Produção da micotoxina citrinina por Penicillium spp.Production of the mycotoxin citrinin by Penicillium spp. (páginas 38-44)