Curvas de desnaturação

As experiências de desnaturação consistiram no registo da absorvância a 260 nm em função da temperatura, entre 20 ºC e 100 ºC, com uma rampa de aquecimento de 1 ºC / minuto. Utilizando o módulo Kinetics, do programa Biochemical Analysis UV-vis

Software, foram registados espetros de cada solução estudada em intervalos de 10

segundos, durante uma rampa programada de temperatura. Usando os valores da calibração da temperatura na célula, as curvas obtidas de absorvância em função do tempo foram convertidas em curvas de absorvância em função da temperatura (equação 1).

Para todos os compostos em estudo, foram realizadas experiências de desnaturação de soluções de ADN (referência) e soluções de ADN+composto, onde apenas a concentração de composto variava. Registou-se também a variação da

absorvância a 260 nm com a temperatura de soluções de cada um dos compostos em estudo, utilizando as mesmas concentrações usadas nas soluções de ADN+composto. As curvas de desnaturação obtidas foram normalizadas, para ser possível fazer uma análise comparativa das mesmas. Para isso, calculou-se para cada curva experimental as curvas correspondentes de A-A20 e (A-A20)/A20, em que A20 representa

a absorvância a 20 ºC.

Com o objetivo de eliminar o efeito da variação de absorvância dos compostos, resultante do aquecimento, nas curvas de desnaturação, calcularam-se as curvas de absorvância corrigidas (Acorr), obtidas por subtração das curvas de aquecimento dos

compostos às curvas de desnaturação de ADN+composto Comparando as curvas corrigidas com a curva de desnaturação de ADN sem composto, é possível verificar o efeito do composto na curva de desnaturação de ADN, resultante da interação entre ambos.

2.3.6. Cálculo da fração de ADN desnaturado e do hipercromismo

A partir dos valores experimentais e dos valores corrigidos de absorvância a 260 nm em função da temperatura, calculou-se a fração de pares de bases de ADN desnaturado, θ, em função da temperatura, usando a equação:20-21

θ =

U(T) - AL(T) (8)

em que AL e AU correspondem à absorvância da linha de base inferior e à absorvância

da linha de base superior, respetivamente, da curva de desnaturação. Estas linhas são obtidas por extrapolação gráfica das regiões lineares da curva de desnaturação, antes e depois do aumento de absorvância característico, como se pode ver na Figura 2.3.

Representando os valores de θ em função da temperatura, determinaram-se os valores de temperatura de desnaturação, Tm, definida como a temperatura na qual

metade do ADN se encontra desnaturado.7, 20-21 _{A temperatura de desnaturação foi}

Figura 2.3 – Representação da absorvância em função da temperatura de uma experiência de desnaturação térmica.

O valor de hipercromismo a 260 nm foi calculado a partir da equação11, 18

H

=

A_L(T) (9)

em que AL(T) e AU(T) são as absorvâncias da amostra nativa e desnaturada,

respetivamente, à temperatura T. Os valores de hipercromismo das curvas de ADN e de ADN+composto foram determinados, em cada experiência, para a temperatura de desnaturação, e para uma temperatura em que o ADN estivesse completamente desnaturado, 80 ºC ou 90 ºC.

2.4. Viscosimetria

A viscosidade é a resistência de um fluido ao cisalhamento ou escoamento e é uma medida da propriedade da adesão/coesão ou da resistência do fluido ao fluxo. A resistência é causada pelo atrito intermolecular exercido quando as camadas de fluido tentam deslizar umas nas outras.83

A_U

AL

A

A adição de uma macromolécula (por exemplo, ADN) a uma solução provoca um aumento da viscosidade da solução. A viscosidade relativa da solução (razão entre a viscosidade da solução com e sem a macromolécula) depende da concentração, da forma e do volume que ocupa a macromolécula.62, 83-85

Medições de viscosidade de soluções de ADN podem ser relacionadas com alterações no comprimento da cadeia do ADN, resultantes da ligação de compostos, com base na equação apresentada por Cohen e Eisenberg.61-63

(

)

= (

) ↔ (

) = (

)

em que L e Lo são os comprimentos da cadeia de ADN e η e ηo são as viscosidades

intrínsecas da solução na presença e ausência de composto, respetivamente.

Dependendo do tipo de ligação, o comprimento da cadeia de ADN pode ou não ser afetado. A ligação por intercalação provoca um aumento da separação dos pares de bases, aumentando assim o comprimento e a viscosidade do ADN. Por outro lado, a ligação de compostos nos sulcos do ADN geralmente não provoca alterações significativas no comprimento da cadeia e, portanto, na viscosidade. As interações eletrostáticas aos grupos fosfato pode provocar uma contração e encurtamento da cadeia, diminuindo assim a viscosidade.47, 56, 63, 86

2.4.1. Equipamento utilizado

Nas experiências de viscosidade utilizou-se um viscosímetro Lovis 2000 ME acoplado a um densímetro DMATM _{4500 M (Figura 2.4).}

O viscosímetro Lovis 2000 ME é um viscosímetro de bola rolante (rolling ball), especialmente indicado para líquidos de baixa viscosidade. A amostra é colocada num capilar de vidro que é introduzido num bloco capilar com temperatura controlada. Este bloco pode ser inclinado com um ângulo predefinido variável. A variação do ângulo de inclinação permite alargar a faixa de medição de um capilar e submeter uma amostra a diferentes taxas de cisalhamento.87

Figura 2.4 - Viscosímetro, Lovis 2000 ME, acoplado a um densímetro, DMATM _{4500 M.}

O viscosímetro de bola rolante é baseado no princípio de Höppler, tal como o viscosímetro clássico de queda de bola, medindo o tempo necessário para uma bola rolar através de um tubo capilar fechado cheio com a amostra, inclinado, sendo medido o tempo de rolamento da bola entre duas marcas definidas.

Utilizou-se o método Lovis/DMA no modo Standard. As medições foram efetuadas colocando a amostra num capilar de vidro de diâmetro interno 1.59 mm, com uma esfera de aço no seu interior, que é colocado num bloco com temperatura controlada. O bloco é inclinado nos dois sentidos até encontrar o ângulo ótimo para realizar a medição. Posteriormente, o aparelho regista o tempo que a esfera demora a percorrer a solução inserida no capilar, nos dois ângulos de rotação e converte-o em viscosidade.87

Como o viscosímetro está acoplado a um densímetro, é possível também, ao mesmo tempo que é medida a viscosidade, medir a densidade da solução graças ao capilar em forma de U no interior do equipamento. O aparelho faz o número de medições necessárias até atingir um coeficiente mínimo de variação entre medições, que está definido por defeito com o valor de 0.10%.87