D OCKING M OLECULAR

O docking molecular é o estudo do melhor ajuste entre duas estruturas tridimensionais (BROOIJMANS e KUNTZ, 2003). Esse processo pode ser dividido nas

Figura 2.5. Compostos com grupo X = SO, apresentando os centros esterogênicos: a. de mesma

configuração relativa (Cr/Sr e Cs/Ss) e b. de configuração opostas (Cr/Ss e Cs/Sr). a

seguintes partes: planejamento do experimento in silico; realização do experimento computacional com objetivo de formar complexos; validação do experimento (redocking); avaliação dos resultados obtidos no experimento.

O programa empregado nas simulações foi o GOLD 5.0 (Genetic Optimization for

Ligand Docking), o qual utiliza um algoritmo genético na busca de uma população de

possíveis soluções.

A função escore utilizada foi a GoldScore, a fim de se ordenar as diferentes soluções obtidas. GoldScore é uma função baseada em mecânica molecular, que possui quatro termos:

GOLD Fitness = Shb_ext + 1.375*Svdw_ext + Shb_int + Svdw_int ,

onde Shb_ext representa a contribuição da energia das ligações de hidrogênio entre a

proteína e o ligante; Svdw_ext a contribuição da energia de van der Waals do complexo

proteína-ligante; Shb_int é a contribuição da energia de ligação de hidrogênio

intramolecular à função; e Svdw_int a energia de van der Waals interna do ligante. A

multiplicação do fator Svdw_ext por 1.375 é uma correção empírica para encorajar os

contatos hidrofóbicos proteína-ligante. Como o GoldScore é tomado como sendo o negativo da soma dos termos de energia componentes, quanto maior o valor do escore, melhor (JONES et al., 1997). O campo de força (mecânica molecular) utilizado no programa GOLD é o Tripos 5.2 Force Field (CLARK, CRAMER, van OPDENBOSCH, 1989).

Para a simulação, foram consideradas as enzimas sob os códigos pdb 3KK6 e 1CX2 no PDB e os ligantes da família dos organocalcogênios obtidos por modelagem molecular. O centro dos cálculos de docking foram os ligantes cristalográficos e a cavidade gerada pela retirada do ligante, e mais 6 Å; no caso de COX-2, isso resultou em uma esfera de 11,005 Å, onde foram considerados 321 átomos nos cálculos. Já para os cálculos com a enzima COX-1, a esfera considerada tinha 10,807 Å e 307 átomos. O programa GOLD utilizado, com a função de ajuste de escore GoldScore, foi a versão 5.0. Foram adicionados os hidrogênios, utilizando subrotina do programa, pois normalmente não estão presentes nas coordenadas obtidas do PDB/PDBSum. Para a proteína é permitida a flexibilidade das hidroxilas dos grupos carboxílicos e no caso dos ligantes, flexibilidade. A His90, presente no sítio ativo foi protonada para a realização dos cálculos. Foram geradas

até 10 saídas (soluções) em cada cálculo, ou até que o rmsd (root-mean-square deviation) entre as saídas fosse menor que 1.5 Å. As moléculas de água foram extraídas, pois análise prévia mostra que não há interação das águas com os ligantes no sítio ativo.

Dessa forma, foram geradas poses1 desses compostos organocalcogênios no sítio de ligação, o sítio ativo característico da atividade ciclooxigenase, com valores de escore associados a cada complexo formado. Estes complexos foram analisados com o programa de visualização molecular DS Visualizer 3.5.

Para se estabelecer os padrões de ligação dos compostos nas enzimas estudadas, uma série de parâmetros foi considerada: as orientações obtidas no cálculo de docking (saídas semelhantes em cada cálculo), as interações que os átomos dos inibidores fazem com átomos de resíduos de aminoácidos da enzima, os escores associados a cada orientação gerada e, por fim, se o modo de ligação é representativo para uma série de compostos de uma mesma família estudada (VEGA-TEIJIDO, CARACELLI e ZUKERMAN- SCHPECTOR, 2006).

2.1.3.1.ALGORITMO GENÉTICO

O Algoritmo Genético (AG) é um algoritmo estocástico utilizado para solucionar problemas de otimização. Os principais conceitos utilizados em AG são: (1) gene: representa cada parâmetro a ser explorado na otimização; (2) cromossomo: também chamado de indivíduo, é a cadeia de genes que representa uma solução possível para o problema; e (3) população: representa o conjunto de soluções no espaço de busca. Os ligantes podem ser rígidos ou flexíveis no Programa GOLD. No caso de considera-los flexíveis, são considerados ângulos torcionais observados na cristalografia. Na linguagem de AG usada, solução representa cada estrutura do ligante que o cálculo de docking ajustou no sítio receptor; orientação representa a posição no sítio que agrupa uma ou mais soluções com RMSD (root mean square deviation) baixo e superposição gráfica que permitem afirmar que formam um grupo de soluções equivalentes.

1 _{Pose, orientação de um ligante em relação a um dado receptor, com uma dada conformação. (Perola et al.} 2002).

Figura 2.6. Fluxograma da operação de um algoritmo genético (adaptação de Miranda, 2000; Corrêa,

2010).

Um número alto de soluções em um grupo será considerado como de certo peso estatístico que favorece a orientação por eles definida e uma delas será selecionada como representante da orientação. As duas primeiras definições referem-se aos complexos; o termo conformação é empregado para a estrutura tridimensional adotada pelo ligante, independentemente de estar ligado ou não.

A produção das soluções nos algoritmos genéticos consiste no cálculo de um grande número de indivíduos, realizando uma varredura tão extensa quanto necessária do espaço de soluções. Para cada indivíduo gerado, uma aptidão é calculada através de uma função de escore (fitness).

2.1.4.REDOCKING

O redocking é uma forma de validar os parâmetros de cálculos para reconstruir a estrutura cristalográfica do complexo receptor COX-ligante. Neste processo, como apresentado na Figura 2.7, o complexo proteína-ligante é separado e os cálculos de docking são realizados com o objetivo de reconstruir o complexo. Para isso são selecionados parâmetros como modo de busca, função de ajuste, raio da esfera construída, flexibilidade ou não de ligantes e/ou proteína.

A predição do modo de ligação é considerada bem sucedida se o rmsd, medida das diferenças entre os valores previstos pelo modelo e aqueles efetivamente observados, for menor do que, geralmente, 2 Å (VERDONK et al., 2003). Se o redocking é realizado com sucesso, então se segue com os ligantes a serem estudados.

Figura 2.7. Etapas utilizadas para o Redocking. O complexo cristalográfico obtido no PDB, formado por

uma proteína e um ligante, é separado e as duas moléculas são utilizadas em cálculos de docking para a reconstrução do complexo. Os parâmetros utilizados para os cálculos que resultam no melhor complexo serão utilizados nos estudos posteriores com a mesma proteína (receptor) e os ligantes de interesse (obtidos por modelagem molecular).