DADOS DE REGIÕES PROMOTORAS DOS GENES MUTM

Para compreender como estão organizados os promotores e motivos reguladores, foram analisadas as sequências nucleotídicas contendo até 1500 pb à montante dos genes MUTM de algumas monocotiledôneas, além da cana- de-açúcar. Estas sequências foram submetidas ao banco de dados PLACE

database® que contém elementos reguladores para analisar a relação entre

estas sequências e as prováveis condições nas quais, estes genes possam ser expressos (http://www.dna.affrc.go.jp/PLACE/).

Portanto, em todos os promotores foram encontrados tanto elementos relacionados a diferentes condições de estresse, como: temperaturas extremas, estresse hídrico, estresse osmótico, salinidade, exposição à luz, patógenos e estresse oxidativo; bem como, elementos para expressão em partes específicas da planta, como: raiz, nódulos, semente, mesófilo e pólen (Tabela 2 - Anexo I e Tabela 3 - Anexo II).

Estes resultados são indícios de que a expressão dos genes MUTM pode ocorrer em resposta a diferentes condições de estresse que causem a produção de agentes oxidantes nas células. Além disso, é possível que a expressão destes genes seja mais bem regulada em tecidos com alta taxa de proliferação, o que é percebido pela presença de elementos que regulam a expressão em semente, e pólen.

45 Nos promotores dos genes AtMMH e AtOGG1 (Arabidopsis thaliana), contendo 1000 pb e 300 pb, respectivamente, encontram-se muitos elementos reguladores comuns aos presentes nos promotores de MUTM da cana-de- açúcar. Dentre os quais, -300element, de expressão na semente;

POLLEN1LELAT52, de expressão no pólen; GT1consensus, de reposta à luz;

entre outros; Estes elementos foram avaliados em outras espécies para testar as suas funcionalidades (THOMAS & FLAVELL, 1990; Le GOURRIEREC, et

al., 1999; FILICHKIN, et al., 2004).

Através da técnica de RT-PCR semiquantitativa, SCORTECCI et al., (2007) utilizaram as sequências dos cDNAs de MUTM1 e MUTM2 de cana-de- açúcar para medir os níveis de expressão dos genes MUTM nesta espécie. O resultado foi que scMUTM1 teve maior nível de expressão em tecidos proliferativos, como flores e ápice meristemático. Entretanto, scMUTM2 apresentou um padrão de expressão constitutivo, sendo expresso em todos os tecidos em níveis semelhantes.

Em sementes transgênicas de Arabidopsis thaliana, a superexpressão induzida de AtOGG1, um gene cuja proteína tem função análoga à MUTM, aumentou a longevidade devido a uma redução no nível de lesões no DNA causadas pela exposição destas sementes a altas temperatura, superóxido e peróxido de hidrogênio (CHEN et al., 2012).

Quando ocorre neofuncionalização ou subfuncionalização a divergência de expressão entre os genes duplicados pode ser assimétrica, variando os níveis de expressão, ou os genes podem ser complementares, onde a cópia com nível superior varie entre órgãos e tecidos (LIU, et al. ,2011). Neste aspecto, os genes scMUTM1 e scMUTM2 podem ser complementares, visto que, como citado acima, scMUTM1 é expresso em tecidos proliferativos e

46 5. CONCLUSÃO E PERSPECTIVAS

Os BACs da cana-de-açúcar são fortemente marcados pela presença de elementos de transposição, o que afeta sua organização e pode alterar a forma de expressão do seu genoma. É necessário caracterizar melhor a atividade destes elementos para reconhecer os verdadeiros impactos que podem ser causados por eles, ou o que já foi alterado até agora.

Os genes scMUTM1 apresentam-se estruturalmente bem conservados, com os tamanhos e a disposição dos éxons e íntrons bastante semelhantes. A diferença mais destacada foi a expansão do terceiro íntron em ambos os BACs, SHCRBa014G09 e SHCRBa179G22, embora não haja sequências de transposons detectáveis nestas regiões. É importante avaliar se a alteração destes íntrons pode influenciar regulação da expressão nestes genes.

Já os genes scMUTM2 mantêm-se conservados em comparação ao sorgo, mas comparando às outras espécies de gramíneas pode-se destacar a presença de elementos transponíveis que alteram a estrutura do gene significativamente. Resta saber se a expressão destes genes pode ser alterada por estes transposons. Ensaios de complementação bacteriana, com linhagens deficientes em reparar DNA, estão sendo realizados para avaliar a capacidade de reparo dos produtos dos cDNAs de genes scMUTM1 e suas remoções da cana-de-açúcar, de modo a caracterizar a atividade de reparo de DNA das proteínas. Estes resultados permitirão caracterizar quais domínios da proteína MUTM afetam a sua atividade de reparo.

O aprofundamento nas análises das regiões promotoras dos genes

MUTM pode contribuir para entender como suas expressões são reguladas e

quais elementos reguladores podem ser utilizados no desenvolvimento de novos promotores que regulem a expressão de genes alvos de forma mais específica. É importante considerar que vários tipos de estresse bióticos e abióticos promovem o aumento das ROS, consequentemente, aumentando os danos por oxidação. .

47 6. REFERÊNCIAS

1. ADAMS, K.L.; WENDEL, J.F. (2005) Polyploidy and genome evolution in plants. Current Opinion in Plant Biology, 8:135–141.

2. AGNEZ-LIMA, L.F.; MEDEIROS, S.R.B.; MAGGI, B.S.; QUARESMA, G.A.S. (2001) Base excision repair in sugarcane. Genetics and Molecular Biology, 24, 123-129.

3. ALTSCHUL, S.F., GISH, W., MILLER, W., MYERS, E.W. & LIPMAN, D.J. (1990) Basic local alignment search tool." J. Mol. Biol. 215:403-410.

4. BAUTE, J.; DEPICKER, A. (2008) Base Excision Repair and its Role in Maintaining Genome Stability. Critical Reviews in Biochemistry and Molecular Biology, 43:239–276, DOI: 10.1080/10409230802309905. 5. BENNETZEN, J. (2000) Transposable element contributions to plant

gene and genome evolution. Plant Molecular Biology 42: 251–269.

6. BRITT, A.B. (1996) DNA damage and repair in plants. Annu. Rev. Plant Physiol. Plant Mol. Biol. 1996. 47:75–100.

7. BRUSKOV, V.I.; MALAKHOVA, L.V.; MASALIMOV, Z.K.; CHERNIKOV, A.V. (2002) Heat-induced formation of reactive oxygen species and 8- oxoguanine, a biomarker of damage to DNA. Nucleic Acid Research, Vol. 30, No. 6, 1354-1363.

8. BUSK, P.K.; PAGÈS, M. (1998) Regulation of abscisic acid-induced transcription. Plant Molecular Biology 37: 425–435.

9. CHEN, H.; CHU, P.; ZHOU, Y.; LI, Y.; LIU, J.; DING, Y.; TSANG, E.W.T.; JIANG, L.; WU, K.; HUANG, S. (2012) Overexpression of AtOGG1, a DNA glycosylase/AP lyase, enhances seed longevity and abiotic stress

48 tolerance in Arabidopsis. Journal of Experimental Botany, 1-15, doi:10.1093/jxb/ers093.

10. CÓRDOBA-CAÑERO, D.; MORALES-RUIZ, T.; ROLDÁN-ARJONA, T.; ARIZA. R.R. (2009) Single-nucleotide and long-patch base excision repair of DNA damage in plants. The Plant Journal, 60, 716–728, doi: 10.1111/j.1365-313X.2009.03994.x.

11. DE ARAUJO, P.G.; ROSSI, M.; DE JESUS, E.M.; SACCARO JR, N.L.; KAJIHARA, D.; MASSA, R.; DE FELIX, J.M.; DRUMMOND, R.D.; FALCO, M.C.; CHABREGAS, S.M.; ULIAN, E.C.; MENOSSI, M.; VAN SLUYS, M.-A. (2005) Transcriptionally active transposable elements in recent hybrid sugarcane. The Plant Journal, 44, 707–717.

12. DE LAAT, W.L.; JASPERS, N.G.J.; HOEIJMAKERS, J.H.J. (1999) Molecular mechanism of nucleotide excision repair. Genes Dev. 13: 768- 785.

13. FESCHOTTE, C.; JIANG, N.; WESSLER, S.R. (2002) Plant transposable elements: where genetics meets genomics. Nature Reviews, Genetics. Vol. 3, 329.

14. FIGUEIRA, T.R.S.; OKURA, V. SILVA, F.R.; SILVA, M.J.; KUDRNA, D.; AMMIRAJU, J.S.S.; TALAG, J.; WING, R.; ARRUDA, P. (2012) A BAC library of the SP80-3280 sugarcane variety (saccharum sp.) and its inferred microsynteny with the sorghum genome. BMC Research Notes 5:185.

15. FILICHKIN, S.A.; LEONARD, J.M.; MONTEROS, A.; LIU, P.-P.; NONOGAKI, H. (2004) a novel endo-β-mannanase gene in tomato leman5 is associated with anther and pollen development. Plant Physiology, Vol. 134: 1080–1087.

49 16. FOYER, C.H. & NOCTOR, G. (2003) Redox sensing and signaling associated with reactive oxygen in chloroplasts, peroxisomes and mitochondria. Physio. Plant. 119: 355-364.

17. FROMME, J.C.; VERDINE, G.L. (2004) Base excision repair. Advances in protein chemistry, Vol. 69, 1-41.

18. GARCÍA-ORTIZ, M.-V.; ARIZA, R.R.; ROLDÁN-ARJONA, T. (2001) An OGG1 orthologue encoding a functional 8-oxoguanine DNA glycosylase/lyase in Arabidopsis thaliana. Plant Molecular Biology 47: 795–804.

19. GARSMEUR, O.; CHARRON, C.; BOCS, S.; JOUFFE, V.; SAMAIN, S.; COULOUX, A.; DROC, G.; ZINI, C.; GLASZMANN, J.-C.; VAN SLUYS, M.-A.; D’HONT, A. (2011) High homologous gene conservation despite extreme autopolyploid redundancy in sugarcane, 189: 629–642, doi: 10.1111/j.1469-8137.2010.03497.x.

20. GLASZMANN, J.C.; DUFOUR, P.; GRIVET, L.; D’HONT, A.; DEU, M.; PAULET F.; HAMON, P. (1997) Comparative genome analysis between several tropical grasses. Euphytica 96: 13–21

21. GRIVET, L.; D'HONT, A.; DUFOUR, P.; HAMON, P.; ROQUES D.; GLASZMANN, J. C. (1994) Comparative genome mapping of sugar cane with other species within the Andropogoneae tribe. Heredity 73, 500-508.

22. HALL, T.A. 1999. BioEdit: a user-friendly biological sequence alignment editor and analysis program for Windows 95/98/NT. Nucl. Acids. Symp. Ser. 41:95-98.

23. HIGO, K., Y. UGAWA, M. IWAMOTO AND T. KORENAGA (1999) Plant cis-acting regulatory DNA elements (PLACE) database. Nucleic Acids Research Vol.27 No.1 pp. 297-300.

50 24. JANSSON, K.; BLOMBERG, A.; SUNNERHAGEN, P.; ROSENBLAD, M.A. (2010) Evolutionary loss of 8-oxo-G repair components among eukaryotes. Genome integrity, 1:12.

25. JOHNSTON, M.O. (2001) Mutation and new variation: Overview. Nature Publishing Group, 1:10.

26. KAPLAN, B.; DAVYDOV, O.; KNIGHT, H.; GALON, Y.; KNIGHT, M.R.; FLUHR, R.; FROMM, H. (2006) The Plant Cell, Vol. 18, 2733–2748. 27. KASHKUSH, K.; FELDMAN, M.; LEVY, A.A. (2003) Transcriptional

activation of retrotransposons alters the expression of adjacent genes in wheat. Nture genetics, vol. 33.

28. KIMURA, S.; SAKAGUCHI, K. (2006) DNA REPAIR IN PLANTS. Chem. Rev. 2006, 106, 753−766.

29. Le GOURRIEREC, J.; LI, Y.-F.; ZHOU, D.-X. (1999) Transcriptional activation by Arabidopsis GT-1 may be through interaction with TFIIA- TBP-TATA complex. The Plant Journal, 18(6), 663-668.

30. LI, A.; SCHUERMANN, D.; GALLEGO, F.; KOVALCHUK, I.; TINLAND, B. (2002) Repair of Damaged DNA by Arabidopsis Cell Extract. The Plant Cell, Vol. 14, 263–273.

31. LIU, S-L.; BAUTE, G.J.; & ADAMS, K.L. (2011) Organ and Cell Type– Specific Complementary Expression Patterns and Regulatory Neofunctionalization between Duplicated Genes in Arabidopsis thaliana. Genome Biol. Evol. Vol. 3, 1419–1436.

32. MENOSSI, M.; SILVA-FILHO, M.C.; VINCENTZ, M.; VAN-SLUYS, M-A.; & SOUZA, G.M. (2007) Sugarcane Functional Genomics: Gene Discovery for Agronomic Trait Development. International Journal of Plant Genomics, Volume 2008, Article ID 458732.

51 33. MICHAELS, M.L.; PHAM, L.; CRUZ, C.; MILLER, J.H. (1991) MUTM, a protein that prevents G C-T A transversions, is formamidopyrimidine- DNA glycosylase. Nucleic Acids Research, Vol. 19, No. 13 3629-3632.

34. MURPHY, T.M. (2005) What is base excision repair good for?: knockout mutants for FPG and OGG glycosylase genes in Arabidopsis. PHYSIOLOGIA PLANTARUM123: 227–232, doi: 10.1111/j.1399- 3054.2004.00453.x.

35. MURPHY, T.M.; GAO, M.-J. (2001) Multiple forms of formamidopyrimidine-DNA glycosylase produced by alternative splicing in Arabidopsis thaliana. Journal of Photochemistry and Photobiology B: Biology 61, 87–93.

36. MURPHY, T.M.; GUO, Y.-Y. (2010) Antimutagenic specificities of two plant glycosylases, oxoguanine glycosylase and formamidopyrimidine glycosylase, assayed in vivo. BBRC, 392, 335–339, doi:10.1016/j.bbrc.2010.01.020.

37. NASH, H.M.; BRUNER, S.D.; SCHÄRER, O.D.; KAWATE, T.; ADDONA, T.A.; SPOONER, E.; LANE, W.S.; VERDINE, G.L. (1996) Cloning of a yeast 8-oxoguanine DNA glycosylase reveals the existence of a base- excision DNA-repair protein superfamily. Current Biology 1996, Vol 6, No 8:968–980.

38. OHTSUBO, T.; MATSUDA, O.; IBA, K.; TERASHIMA, I.; SEKIGUCHI, M.; NAKABEPP, Y. (1998) Molecular cloning of AtMMH,an Arabidopsis thaliana ortholog of the Escherichia coli MutM gene, and analysis of functional domains of its product. Mol. Gen. Genet. 259: 577-590.

39. PITZSCHKE, A.; FORZANI, C.; HIRT, H. (2006) Reactive Oxygen Species Signaling in Plants. Antioxidants & redox signaling, Volume 8, Numbers 9 & 10.

52 40. REGUERA, M.; PELEG, Z.; & BLUMWALD, E. (2011) Targeting metabolic pathways for genetic engineering abiotic stress-tolerance in crops. BBAGRM-00378

41. PRESTRIDGE, D.S. (1991) SIGNAL SCAN: A computer program that scans DNA sequences for eukaryotic transcriptional elements. CABIOS 7, 203-206.

42. ROJAS, C.A.; HEMERLY, A.S., & FERREIRA, P.C.G. (2010) Genetically modified crops for biomass increase: Genes and strategies. GM Crops 1:3, 137-142.

43. ROLDÁN-ARJONA, T.; ARIZA, R.R. (2008) Repair and tolerance of oxidative DNA damage in plants. Mutation Research Review, 7913, doi:10.1016/j.mrrev.2008.07.003.

44. SCANDALIOS, J.G. (2005) Oxidative stress: molecular perception and transduction of signals triggering antioxidant gene defenses. Brazilian Journal of Medical and Biological Research (2005) 38: 995-1014.

45. SCORTECCI, K.C., LIMA, A.F.O.; CARVALHO, F.N.; SILVA, U.B.; AGNEZ-LIMA, L.F.; MEDEIROS, S.R.B. (2007) A characterization of a

MUTM/FPG ortholog in sugarcane – A monocot plant. BBRC, 361,

1054–1060.

46. SHARMA, P.; JHA, A.B.; DUBEY, R.S.; & PESSARAKLI, M. (2012) Reactive Oxygen Species, Oxidative Damage, and Antioxidative Defense Mechanism in Plants under Stressful Conditions. Journal of Botany, Volume 2012, Article ID 217037.

47. SINGH, K.B. (1998) Transcriptional Regulation in Plants: The Importance of Combinatorial Control. Plant Physiol. 118: 1111–1120.

48. SUGAHARA, M.; MIKAWA, T.; KUMASAKA, T.; YAMAMOTO, M.; KATO, R.; FUKUYAMA, K.; INOUE, Y.; KURAMITSU, S. (2000) Crystal

53 structure of a repair enzyme of oxidatively damaged DNA, MutM (Fpg), from a extreme thermophile, Thermus thermophiles HB8. The EMBO Journal, vol. 19, No. 15, 3857-3869.

49. TAMURA K, PETERSON D, PETERSON N, STECHER G, NEI M, AND