Apresentação do Projeto: Introdução:
O câncer de mama é o tipo de câncer mais comumente diagnosticado e com maior número de mortes em mulheres no mundo, acometendo 23% do total de casos de câncer e 14% de mortes relacionadas a esta doença [1]. No Brasil, o Instituto Nacional de Câncer (INCA) estimou uma incidência de 57.120 novos casos de câncer de mama em 2014, com um risco estimado de 56,09 casos a cada 100 mil mulheres. Dentre os fatores de risco associados ao desenvolvimento da doença destacam-se a idade, influências hormonais associadas à exposição a estrogênio, hábitos alimentares (por exemplo, a ingestão de gordura saturada), e outros fatores ambientais [2,3]. Além disso, aspectos genéticos estão associados à ocorrência do câncer de mama familial, uma vez que parentes de primeiro grau dos indivíduos portadores são afetados de maneira autossômica dominante e tem um risco duas vezes maior de desenvolver a doença. De modo complementar, acredita-se que cerca de 10% dos casos de câncer de mama são hereditários, nos quais o principal fator determinante na predisposição são as mutações germinativas nos genes BRCA1 e BRCA2 [2,4].Em relação à idade, estima-se que mais de 40% das pacientes acometidas pela doença tenham idade superior a 65 anos, e que estas representem aproximadamente 60% do total de mortes por câncer de mama [5]. É interessante notar que antes dos 49 anos de idade, a chance de desenvolver esta neoplasia é de 1/53, passando para 1/43 entre mulheres com 50-59 anos, 1/23 para aquelas com idade variando entre 60-69 anos e 1/15 em idosas com mais de 70 anos [6].
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Continuação do Parecer: 2.959.022Tendo em vista que a estimativa de vida está aumentando, acredita-se que, num futuro próximo, mais de 20% da população terá mais de 65 anos, o que consequentemente aumentará o número de pacientes com câncer de mama. O câncer de mama é uma doença clinicamente e biologicamente heterogênea, caracterizada pela desregulação de múltiplas vias celulares e diferenças na sensibilidade ao tratamento, podendo contribuir para sobrevida da paciente [7-9]. O carcinoma de mama pode ser categorizado em in situ ou invasivo. O carcinoma in situ é classificado em ductal ou lobular sendo diferenciado pelo padrão de crescimento e características morfológicas. O carcinoma ductal in situ é o mais comum, podendo ainda ser classificado em diferentes subtipos de acordo com o perfil dos marcadores de receptor de estrógeno (RE), receptor de progesterona (RPg), receptor do fator de crescimento epidermal humano 2 (HER2) e TP53 [10- 12]. Assim como o carcinoma in situ, os carcinomas invasivos se distinguem em diferentes tipos histológicos, incluindo ductal, lobular, ductal/lobular, mucinoso, tubular, medular e papilar. Esses tumores são classificados em diferentes subtipos de acordo com a expressão de RE, RPg, HER2 e Ki-67. A expressão desses marcadores possibilitam estimar a resposta à terapia (fatores preditivos da resposta) e o prognóstico [13]. Sabe-se, por exemplo, que pacientes com carcinomas que não expressam RE/RPg/HER2, embora respondam bem a quimioterapia, são associados com um pior prognóstico. Já aquelas com carcinomas que expressam os receptores hormonais, não expressam o HER2 e tem baixa proliferação, respondem bem a hormonioterapia e apresentam um bom prognóstico [14]. Apesar da análise destes marcadores moleculares serem determinantes na escolha terapêutica existe substancial heterogeneidade dentro de cada subtipo, levando a variabilidade na resposta terapêutica. Os tumores denominados luminais são aqueles que apresentam receptores hormonais positivos e são divididos em: luminal A (RE positivos e RPg presentes em pelo menos 20% das células, HER2 negativo e baixo Ki-67) e luminal B (RE positivos, RPg negativos ou expressos em menos de 20% das células e/ou HER2 positivo e/ou Ki-67 elevado). Os tumores não-luminais não expressam receptores hormonais e podem ou não expressar o HER2 [15]. Ao contrário dos carcinomas luminais que tem um bom prognóstico porem não respondem tão bem a quimiterapia, os carcinomas não-luminais, essencialmente os triplo negativos, apresentam boa resposta à quimioterapia neoadjuvante porém tem um prognóstico mais reservado. Entre as pacientes que receberam quimioterapia neoadjuvante, aquelas que atingiram uma reposta patológica completa apresentaram taxas de sobrevida livre e global da doença significativamente melhores [16].Do ponto de vista genético diversas mutações já foram associadas ao desenvolvimento de câncer de mama. Dentre estas se destacam mutações que causam a desregulação de genes que controlam ciclo celular tais como: BRCA1, BRCA2, HER2,
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Continuação do Parecer: 2.959.022PIK3CA, TP53, MDM2 e RB. Acredita-se que estas tanto podem desencadear a tumorigênese como podem influenciar a resposta terapêutica [17]. Dentre os genes citados acima, pela importância clínica, destacam-se BRCA1 e BRCA2. BRCA1 codifica uma proteína de reparo ao DNA e tem papel fundamental no desenvolvimento do câncer de mama hereditário. Esta proteína interage com a RNA polimerase II e com complexos deacetiladores de histona, agindo na transcrição e no reparo de quebra de fita dupla do DNA [18]. BRCA2 também está envolvida no reparo de quebra de fita dupla do DNA, interagindo com RAD51 para iniciar o processo de recombinação homóloga [19]. Disfunções nas vias de BRCA, portanto, se devem principalmente ao comprometimento da quebra de fita dupla do DNA levando a instabilidade genômica. As platinas são quimioterápicos que induzem dano ao DNA, através da quebra de fita dupla. Por esse motivo, os carcinomas triplo negativos parecem ser particularmente sensíveis à quimioterapia baseada em platina [20]. O risco de um portador de mutação em BRCA1/ BRCA2 desenvolver câncer de mama é estimado em 60-80%. Além desses 2 genes, existem outros genes com função no reparo ao DNA que estão associados com câncer de mama, incluindo: MLH1, MSH2, PMSI, MSH6, PMS2 (mismatch repair genes), ATM, ATR, CHK1, CHK2 (sensores de dano ao DNA) e TP53 [17,21,22]. A via de resposta ao dano ao DNA (DDR) é ativada em resposta a danos genotóxicos em que os sensores enviam dois sinais: o primeiro sinal ativa a via de checkpoint que pára o ciclo celular tanto em G1 como em G2; o segundo sinal leva a ativação do reparo ao DNA [23]. Depois do dano ao DNA, um complexo proteico é recrutado no sítio afetado facilitando a fosforilação e ativação de CHK1 mediada por ATR. CHK1 é uma proteína kinase que regula a progressão da fase S e parada do ciclo em G2/M [24]. Outro complexo que funciona como sensor de dano ao DNA é o MRE11-RAD50-NBS1 (MRN), que detecta quebra em fita dupla (DSB), recruta ATM que fosforila a histona H2AX (H2AX) no local da quebra [25]. Estudos apontam que as cancer stem cells (CSCs) podem promover quimiorresistência [26]. Essas ações são parcialmente mediadas através de DDR [27,28]. Além disso, sabe- se que a transição epitélio-mesenquimal (EMT), induzida por diversos fatores de transcrição como TWIST, SNAIL e SLUG pode gerar células com características de células tronco e regular o processo de quimiorresistência associada às CSCs. De fato, em um estudo conduzido por Zhang e colaboradores [29] mostrou que reguladores de EMT promovem DDR e radiorresistência através de um processo envolvendo ATM e CHK1.Apesar dos avanços no conhecimento genético-molecular do câncer de mama, esta neoplasia continua sendo a maior causa de morte por câncer entre mulheres no mundo, devido principalmente ao processo metastático e à resistência ao tratamento. Sugere-se que uma subpopulação de células presentes na massa tumoral seja resistente à quimioterapia e radioterapia e assim, seja capaz de iniciar o crescimento tumoral e
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Continuação do Parecer: 2.959.022direcionar a progressão da doença [30,31]. Essas células tem característica de células tronco e podem ser identificadas pela expressão de determinados marcadores de superfície (CD44+/CD24-, no caso de câncer de mama), pela capacidade de crescimento em condições não-aderentes e pela capacidade de se autorregenerar [32]. Acredita-se que a massa tumoral seja composta por cerca de 1% de CSCs, e que isto seja suficiente para formar o tumor. Em seu estudo, Ginestier [33] demonstrou que somente 20 células com perfil CD44+/CD24-/ALDH+ eram capazes de formar tumores in vivo.A presença dessas células em mama foi primeiramente observada em 2003 [34]. Existem duas hipóteses que explicam a origem dessas CSCs em câncer de mama. A primeira propõe que resulte da desregulação de células tronco normais, resultando em células tumorais com capacidade de autorregeneração e diferenciação, principalmente devido a uma alta taxa de mutação e transformação oncogênica atribuídos ao longo tempo de vida destas células. A segunda hipótese é que as CSCs de mama se desenvolvem a partir da EMT, sendo mais suscetíveis à transformação neoplásica [31]. Várias vias celulares são responsáveis por regular e manter as características de CSCs de mama tais como: Notch, Hedgehog e Wnt. Adicionalmente, existem fatores de transcrição importantes neste processo, como NFB e SOX9. Neste sentido, SOX9 tem um papel determinante na indução de EMT e sua alta expressão é essencial para manter o estado CSC de mama [35]. SOX9 é um fator de transcrição nuclear que contém três domínios altamente conservados: um domínio HMG que se liga no DNA de maneira específica, e dois outros domínios, um C-terminal PQS e um PQA, ambos requeridos para a atividade transcricional de SOX9. Recentemente foi demonstrado que o aumento na expressão de SOX9 é associado com RE negativo em tumores de mama e com uma menor sobrevida [36,37]. Drogas citotóxicas anticâncer combatem as células em ativa proliferação e não agem naquelas que se dividem lentamente. Entretanto, mecanismos de resistência podem escapar ao efeito citotóxico induzido pela quimioterapia. Podem ocorrer dois tipos de resistência à quimioterapia: (1) o intrínseco, em que o paciente não responde ao tratamento porque as células tumorais escapam das vias pelas quais a droga age ou pela incapacidade de estas células absorverem a droga; e (2) o adquirido, em que inicialmente, o paciente responde ao tratamento, mas depois se torna resistente. Em ambos os casos o tratamento não é efetivo levando a um quadro desfavorável ao paciente [38]. A quimioterapia neoadjuvante oferece uma oportunidade de avaliar a resposta tumoral in vivo, avaliar biomarcadores e observar mecanismos de resistência [39]. A possibilidade de avaliar a resposta ao tratamento com biópsias do tecido tumoral durante e no final do tratamento é o cenário ideal para a identificação de biomarcadores. Além disso, tem sido proposta uma associação entre a resistência ao tratamento e as CSCs de mama, uma vez que existe um elevado
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Continuação do Parecer: 2.959.022número de células CD44+/CD24- no tumor residual pós quimioterapia [40]. Um possível mecanismo para explicar esta relação está no perfil quiescente das CSCs, o que contrasta com o modo de ação das drogas quimioterápicas que alvejam as células em rápida divisão celular. Além disso, tem sido reportado que estas células possuem uma elevada expressão de proteínas anti-apoptóticas, tais como BCL-2 e survivin, e proteínas envolvidas em mecanismos de efluxo de bombeamento, que diminuem a capacidade das células em reter as drogas [41]. De acordo com essa hipótese, a quimioterapia mataria efetivamente as células tumorais que se dividem muito rapidamente, porém não afetaria as CSCs, exercendo assim uma pressão seletiva, em que essas células passariam essa sensibilidade às células filhas, promovendo resistência clínica e maior agressividade do tumor ao longo do tempo [31]. Por essa razão, elucidar o mecanismo molecular em que as CSCs sobrevivem à terapia é fundamental para identificar novos alvos terapêuticos mais adequados para cada tipo de câncer de mama.Sabe-se que as CSCs são associadas à um alto grau de plasticidade, necessários para autorrenovação e diferenciação. Tem sido proposto que tal plasticidade é mantida por modificações epigenéticas, incluindo metilação do DNA, modificações em histonas e modulação por RNAs não codificantes [42]. Acredita-se que a desregulação das modificações epigenéticas podem contribuir significativamente para o desenvolvimento tumoral, podendo controlar a plasticidade das CSCs [43]. A indução de alguns modificadores epigenéticos, como BMI1 e EZH2, tem sido associada à indução da plasticidade das CSCs de mama [44]. Em contrapartida, o silenciamento epigenético mediado pela metilação da região promotora de genes com função na pluripotência e autorrenovação é essencial para a diferenciação epitelial mamária. Além disso, recentemente o papel dos microRNAs (miRNA) na manutenção das CSCs tem ganhado muita atenção [45]. Os miRNAs são uma classe de pequenas moléculas RNA não codificantes, com cerca de 20 nucleotídeos, que possuem grande importância como reguladores pós transcricionais, uma vez que regulam aproximadamente 30% de todo o genoma. Esses pequenos RNAs regulam negativamente a expressão gênica por meio de sua capacidade de ligação com a região 3’ não traduzida (3’UTR) do(s) RNA(s)m alvo(s), o que consequentemente levaria a uma redução no processo de tradução [46]. Esses miRNAs estão desregulados em quase todos os tipos de câncer, inclusive câncer de mama. Recentemente, alguns estudos têm demostrado o papel dos miRNAs especificamente na determinação do fenótipo de CSCs de mama [47-49]. Por exemplo, o miRNA let-7 tem um papel importante na manutenção da capacidade de autorrenovação e estado indiferenciado de CSCs de mama [50], enquanto o miR-200 inibe a expressão de BMI1 tendo assim um papel fundamental no processo de regulação CSCs e EMT. Em pacientes com câncer de mama o miR-200 encontra-se reprimido, o que leva à ativação de BMI1 e à desregulação do processo de
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Continuação do Parecer: 2.959.022EMT [47]. Outro estudo mostrou que o miR-140 está desregulado em células tumorais de mama e contribui para a formação de CSCs, tendo como alvo SOX9 e ALDH1 [51]. Em relação ao tratamento, alguns trabalhos sugerem a importância dos miRNAs na quimiorresistência em vários tipos de câncer [52,53]. No caso de câncer de mama, vários miRNAs já foram identificados como reguladores de resistência à droga (doxorrubicina, mitoxantrono e tamoxifeno) [54], como por exemplo, a alta expressão do miR-21 que causa resistência ao trastuzumab pela repressão do seu alvo PTEN durante uma longa exposição à este medicamento. Adicionalmente, Bockhorn e colaboradores [55] reportaram que o miR-30c suprime a expressão de IL11 e inibe a resistência a paclitaxel e doxorrubicina pela promoção do fenótipo de EMT. Por outro lado, repressão do miR-199b-5p mediada pela metilação de seu promotor foi associado à resistência à cisplatina em células tumorais de ovário [56]. Outro fator importante do ponto de vista da terapia contra as CSCs de mama é avaliar sua interação com o microambiente local. A comunicação das células tumorais com seu microambiente tem um papel fundamental no desenvolvimento e progressão do câncer, uma vez que essas células podem acessar o oxigênio e nutrientes que suportam o crescimento tumoral. Além disso, o microambiente tumoral composto por exossomos pode permitir a comunicação de uma célula tumoral com a célula tumoral vizinha e assim promover invasão e migração [57]. Os exossomos são pequenas vesículas de 30-100 nm de diâmetro parecidas com as vesículas internas presentes no endossomo [58]. Essas microvesículas podem ser liberadas por diferentes tipos celulares, incluindo células tumorais, hemácias, linfócitos, plaquetas, células dendríticas, adipócitos, CSCs [59,60]. Estas são compostas por RNAs, miRNAs e proteínas, permitindo a transferência desse conteúdo de uma célula à outra [61]. Essa transferência molecular é de extrema importância, uma vez que atua como um regulador de diversos processos celulares, nos ajudando a compreender a complexidade da progressão tumoral e sua terapia. A transferência de RNA, miRNA e proteínas através dos exossomos é mediada pela fusão da membrana plasmática da célula receptora, por um mecanismo que não é completamente entendido, mas provavelmente possibilitada pela acidez encontrada no microambiente [62]. Como essas moléculas podem ser encontradas nos fluídos corporais, elas também podem ser usadas como potenciais biomarcadores de determinados subtipos de câncer de mama e assim, guiar a resposta terapêutica. É interessante ressaltar que as CSCs são resistentes à quimioterapia, e dessa forma, os exossomos liberados por essas células poderiam “levar” essa quimioresistência às células tumorais, assim como, os exossomos liberados pelas células tumorais poderiam aumentar a formação das CSCs [63] e contribuir para a agressividade da doença. Tendo em vista as evidências que suportam a hipótese de que apenas 1% de células tumorais dentro do tumor com
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Continuação do Parecer: 2.959.022características de CSCs seriam suficiente para formar um tumor com fenótipo mais agressivo, com capacidade de migração, metástase, resistência ao tratamento e recorrência da doença, assim como a escassez de estudos que determinem com clareza a interação dessas CSCs com seu microambiente, pretende-se avaliar o papel dos exossomos derivados de CSCs na transferência de marcadores que regulem a quimiorresistência em câncer de mama. O melhor entendimento desses mecanismos permitirá o desenvolvimento de estratégias terapêuticas capazes de atuar precocemente e inibir a disseminação de células tumorais, com impacto significativo na sobrevida das pacientes.
Hipótese:
1) Pode ser induzida a resistência a doxorrubicina, paclitaxel e carboplatina em células tumorais de mama in vitro;
2) CSCs de mama podem ser isoladas e caracterizadas in vitro;
3) Exossomos oriundo de CSCs e células tumorais de mama podem ser liberados, isolados e caracterizados; 4)Em células tumorais e CSCs mama quimiorresistentes serão fenotipicamente distintas e terão alteração do padrão de expressão de miRNAs quando comparadas com células sensíveis às drogas utilizadas;
5)Os exossomos oriundos das CSCs e células quimiorresistentes de mama terão alterações moleculares associadas à quimiorresistência e possibilitarão a transferência de miRNAs associados à quimiorresistência; 6)O tecido tumoral, plasma e exossomos das pacientes com câncer de mama terão alteração de expressão dos miRNAs avaliados;
7) A expressão dos miRNAs oriundos de exossomos e plasma de pacientes com câncer de mama estará relacionada com a quimiorresistência.
Metodologia Proposta:
Metodologia: Será realizada uma análise in vitro com estabelecimento de células tumorais de mama resistentes à doxorrubicina, paclitaxel e carboplatina, isolamento e caracterização de CSCs de mama; indução da liberação, isolamento e caracterização de exossomos por CSCs, células tumorais resistentes e não resistentes de mama; análise do perfil de expressão de genes de reparo ao DNA, genes associados com EMT e miRNAs e seus alvos associados à quimioresistência células
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Continuação do Parecer: 2.959.022tumorais resistentes e não resistentes de mama, em mamoesferas e em exossomos; co-cultura de exossomos derivados de mamoesferas em células tumorais resistentes e não resistentes de mama. Para análise in vivo será avaliada a expressão dos miRNA relacionados a quimioresistência no tecido tumoral e no plasma de mulheres com carcinoma de mama, antes e depois da quimioterapia. Para o tamanho amostral utilizou-se um fold-change padrão de 2 vezes na expressão de microRNAs, com poder estatístico de 80% e erro- de 0,05. Dessa forma, o número de pacientes é de 200 mulheres. Serão selecionadas para este estudo as amostras de tecido e sangue das mulheres com carcinoma invasor de mama, tratadas com quimioterapia neoadjuvante com doxorrubicina, paclitaxel e/ou carboplatina. O sangue e o tecido das mulheres com câncer de mama é coletado no momento do diagnóstico e na cirurgia para tratamento do câncer para o Biobanco do Centro de Atenção Integral à Saúde da Mulher (CAISM-UNICAMP) (CONEP B-
056) após esclarecimento das pacientes que assinam o Termo de Consentimento Livre e Esclarecido. A indicação do tratamento é realizada de acordo com protocolo assistencial do serviço e esse projeto não irá interferir na conduta clínica.
Objetivo da Pesquisa:
Objetivo Primário:
Identificação de possíveis alvos moleculares que determinem a quimiorresistência através da transferência de biomarcadores oriundos de câncer stem cells (CSCs) para células tumorais de mama.
Objetivo Secundário:
1) Indução da resistência à doxorrubicina, paclitaxel e carboplatina em células tumorais de mama;2) Isolamento e caracterização de CSCs de mama;3) Liberação, isolamento e caracterização de exossomos oriundo de CSCs e células tumorais de mama;4) Análise do perfil de expressão de genes de reparo ao DNA, genes associados com EMT e miRNAs e seus alvos em células tumorais resistentes e não resistentes de mama e em CSCs;5) Co-cultura de exossomos derivados de CSCs em células tumorais resistentes de mama;6) Análise de expressão dos miRNA relacionados com quimiorresistê ncia de tecidos tumorais e adjacentes ao tumor de pacientes com câncer de mama;7) Análise de expressão dos miRNAs relacionados com quimiorresistência oriundos de exossomos e plasma de pacientes com câncer de mama.