Dekkera bruxellensis

A levedura Dekkera bruxellensis (Reino Fungi, sub-Reino Dikarya, Filo

Ascomycota, sub-Filo Saccharomycotina, Classe Saccharomycetes, Ordem

Saccharomycetales, Família Saccharomycetaceae, gênero Dekkera) agrupa leveduras que apresentam estruturas unicelulares, reproduzem assexuadamente predominantemente por brotamento multilateral e produzem ascopoporos em ascos livres que se originam a partir de um zigoto ou por partenogênese de uma célula somática(Van der Walt, 1964). É considerada a fase teleomorfa da espécie Brettanomyces bruxellensis.

Esse grupo de leveduras Brettanomyces/Dekkera foi inicialmente descoberto por Claussen em 1904 a partir de isolados de leveduras de cerveja inglesa (daí o nome Brettanomyces, que derivou do termo “britsh”) de sabor e aroma encorpado ao final da fermentação (Basso, et al. 2008) Em 1940, Custer definiu as primeiras características fisiológicas dessa levedura em sua capacidade fermentativa de síntese de ácido acético, crescimento lento em meios contendo extrato de malte e seu curto período de sobrevivência. Morfologicamente apresentam células ogivais (estrutura semelhante à chama de uma vela nas extremidades) com possibilidade de formação de pseudo-hifas, que depende do estado nutricional do meio e presença ou ausência de ascósporos (Figuras 6 e 7). Durante sua reprodução sexuada, os ascos são evanescentes e possuem de um a quatro ascósporos, que apresentam um formato de chapéu ou esféricos com uma borda tangencial que quando liberados tendem a se agrupar (Figura 5). A diferença entre esses gêneros se dá simplesmente pelo fato de Brettanomyces (Figura 6) não apresentar ascósporos (fase imperfeita da levedura – anamórfica)(Van Der Walt, 1964). Como aspecto macroscópico, Dekkera/Brettanomyces possui características culturais em meios líquido e sólido bem particulares. Em meio líquido, formam um anel delgado que finaliza pela presença de uma película fina com existência de sedimento floculoso e mucoso após dez dias de cultivo. Em meio sólido (ágar malte), as colônias apresentam colorações que variam de creme a marrom clara e salmão, com aspecto liso ou crespo com margens onduladas ou lobulosas. Na presença de carbonato de cálcio, as colônias formam crateras

34 e o odor ácido é bem característico e percebido facilmente (De Souza Liberal, et al., 2005).

A taxionomia do gênero Brettanomyces (atualmente atribuída à forma anamórfica das espécies pertencentes de Dekkera) tem sido debatida desde a sua descoberta e foram realizadas várias reclassificações ao longo dos últimos anos. A classificação inicial foi baseada em algumas espécies que reproduzem assexuadamente (forma anamórfica) através de brotamento multipolar). Pouco tempo depois, na formação de ascósporos foi observado que o gênero Dekkera que se reproduz sexualmente (fase teleomórfica), e o gênero Dekkera foi aceito (van der Walt 1964). A taxionomia atual inclui algumas espécies dentro do gênero Dekkera/Brettanomyces. Esses são os anamorfos B. bruxellensis, B. anomalus, B. custersianus, B. naardenensis e B. nanus, e os teleomorfos D. bruxellensis e D. anomala (Van Der Walt, 1964) A distinção entre

Dekkera e Brettanomyces foi discutida por Oelofse et al. (2009) citando Loureiro e

Malfeito-Ferreira a partir de 2006, quando afirmou que as técnicas atuais de detecção molecular de ADN não revelaram variação entre os estados anamórficos e teleomórficos. Como existe uma grande importância industrial, no que se refere às suas características fermentativas, existe a utilização de pelo menos duas espécies de Brettanomyces disponíveis no mercado. As duas espécies são B. bruxellensis e B. anomalus sendo a B.

bruxellensis a estirpe mais usada, justamente devido à sua capacidade de sintetizar β-

glicosidases capazes de liberar agliconas com características organolépticas bastante apreciadas em bebidas alcoólicas. As principais características bioquímicas de D.

bruxellensis estão apresentadas na Tabela 1. Além disso, as células desta espécie são mais

resistentes do que a maioria das leveduras aos compostos cicloeximida (actidiona) em até 50 µg.mL-1 e ácido ascórbico em até 500 µg.mL-1 o que facilita seu isolamento de amostras industriais e ambientais.

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Tabela 4. Assimilação de açúcares pelas espécies Dekkera (Van Der Walt, 1964) e

Brettanomyces (Van Der Walt, 1964).

Leveduras Gal Sac Mal Cel Tre Lac Raf Amisol Dxilo Larab Dribo Rama Eritr Ribi Dmani Succ Citr Inos

D. bruxellensis - + + - + - +F - - - V - - V - V - - D. intermedia + +L +L + + - V - - - V - - V - V - - B. abstinens + - - + - - - - B. anomalus + + + + + + +L - - - V - - V - V - - B. bruxellensis - + + - + - +F - - - V - - V - V - - B. claussenii - + + + + + +F - - - V - - V - V - - B. custersianus +/- F +F +/- F - + - - - V - - V - + - - B. custersii + + + + + +L +L - - - +L - - V - +L - - B. intermedius + + + + + - V - - - V - - V - V - - B. lambicus +L + + - + - - - +L - - - V - - B. naardenensis +L - + + + - - +L + - - V - V + + - -

Gal= galactose; Sac= sacarose; Mal= maltose; Cel= celobiose; Tre= trealose; Lac= lactose; Raf=rafinose; Amisol= Amido solúvel; Dxilo= D-xilose; Larab= L-arabinose; Dribo= D-ribose;. Rama=ramanose; Eritr= eritritol; Ribi= Ribitol; Dmani= D-manitol; Succ= ácido succínico; Citr= ácido cítrico;Inosi= inositol; (-) = negativo; (+)= positivo rápido; (+F)= positivo fraco; (V)= variado; (+L)= positivo lento;(-/+F)= negativo ou positivo fraco

Apesar das dificuldades de interpretação dos testes bioquímicos, ocasionadas pelos inconvenientes de interpretação de fracos positivos (+F), de negativo a fraco positivo (+/-F) e ainda as variáveis (V), existe uma chave para identificação baseada em testes fisiológicos de crescimento em placa para espécies do gênero Dekkera e

Brettanomyces que pode auxiliar na triagem, entretanto deve-se levar em consideração

que as análises macroscópicas e, principalmente, microscópicas são essenciais no reconhecimento da espécie. As figuras 7, 8 e 9 ilustram, respectivamente, a

caracterização fisiológica em placas de cultivo para espécies de

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Figura 6. Ascos de Dekkera bruxellensis, meio YM com vitaminas, (Fonte Van der

WALT, 1964)

Figura 7. Células de Brettanomyces bruxellensis, Meio de extrato de malte. (Fonte Van der

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Figura 8. Mecanismos fisiológicos de Brettanomyces: F+, fermentação positiva; F-,

fermentação negativa; A+, assimilação positiva; A-, assimilação negativa (Fonte: Van der WALT, 1964).

Figura 9. Características fisiológicas/culturais de Dekkera segundo Van der WALT (1964).

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Figura 10. Identificação de espécies do gênero Dekkera. F+, fermentação positiva; F-,

fermentação negativa; C+, crescimento; C-, não crescimento (Fonte: Van der WALT, 1964). Ainda como uma abordagem sobre as características metabólicas, em trabalho recente Tiukova et al (2013) analisaram a expressão gênica global de um isolado industrial D. bruxellensis CBS 11270 sob aerobiose restrita e limitação de demanda de glicose, por sequenciamento de todo o transcriptoma (figura 11) usando a tecnologia AB SOLiD e observaram a expressão do complexo I NADH-Ubiquinona redutase, embora

D. bruxellensis seja uma levedura Crabtree positiva. Também observaram maior

expressão de enzimas de geração de NADH em comparação com enzimas NAD + pode ser a razão para o desequilíbrio NADH anteriormente observado e resultando em efeito Custer em D. bruxellensis. Baixa expressão de genes envolvidos na produção de glicerol é provavelmente a base molecular para a alta eficiência de D. bruxellensis sob condições de limitação de nutrientes. E o elevado número de genes transportadores de açúcar expressos é consistente com a hipótese de que a competitividade da D. bruxellensis é devido a uma maior afinidade para a limitação de nutrientes.

A indústria sucro-alcooleira tem uma grande necessidade de encontrar uma levedura com essas características fisiológicas de conversão de hidrolisados

39 lignocelulósicos em etanol. Isto é possível a partir de um pré-tratamento da biomassa que apresente um excelente rendimento em produção de celulose e pentoses, nesta Tese sugere-se o pré-tratamento utilizando peróxido de hidrogênio em meio alcalino brando seguido de uma hidrólise enzimática mediada por uma preparação protéica comercial e uma linhagem de levedura adaptada às condições fermentativas industriais como D.

bruxellensis GDB 248, inclusive sob condições limítrofes de suplementação com

nitrogênio como descrito por (de Barros Pita, 2011; Leite, 2013) e relacionando essas características fermentativas com o seu papel ecológico nas dornas de fermentação com

S. cerevisiae. Por isso justificam-se os estudos desenvolvidos até o momento que

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Figura 11. A expressão dos genes envolvidos no metabolismo do carbono central. RPKM é uma medida

do nível da expressão de genes expressos como um número de leituras por 1-K pares de bases (Tiukova et al.,2013)

41 4. CAPÍTULO 1: Fer mentação da celobi ose e m con dições de aerobiose restrita e a caracterização de u ma celobiase a partir de

u ma linhage m in dustrial de Dekkera/Brettanomyces bruxellensis

Alexandre Libanio Silva Reis1*, Raquel de Fátima Rodrigues de Souza2, Rochane Regina Neves Baptista Torres2, Fernanda Cristina Bezerra Leite2, Patrícia Maria Guedes Paiva3, Esteban Espinosa Vidal1 e Marcos Antonio de Morais Jr1,2,3,4

1 _{Laboratório de Bioprocessos, CETENE. 50740-540 Recife, PE, Brazil.}

2_{Núcleo Interdeparmental de Engenharia Metabólica,} 3_{Departmento de Genética e} 4_{Departmento de Bioquímica, Universidade Federal de Pernambuco. 50670-901 Recife,} PE, Brasil.

*Autor para correspondência: Alexandre Libanio Silva Reis

Centro de Tecnologias Estratégicas do Nordeste - CETENE

Av. Prof. Luiz Freire, 01 - Cidade Universitária 50740-540, Recife PE Brasil E-mail: libanio.reis@gmail.com

Fone: 55-81-3334-7262 Fax: 55-81-3334-7200

Trabalho aceito para publicação como “Oxygen-limited cellobiose fermentation and the characterization of the cellobiase of an industrial Dekkera/Brettanomyces bruxellensis strain”. SpringerPlus Open Access, em 14 de janeiro de 2014

42 RESUMO

A descoberta de uma nova linhagem de levedura, isolada dos processos de fermentação industriais, com uma capacidade natural para produzir etanol a partir de substratos lignocelulósicos (etanol de segunda geração) é de grande importância para a tecnologia de produção de bioetanol. Embora existam algumas leveduras capazes de assimilar celobiose em condições aeróbicas de laboratório, o açúcar predominante no tratamento de material lignocelulósico, pouco se sabe sobre esta capacidade em condições industriais reais. As fermentações foram realizadas simulando as condições industriais, utilizando meios sintéticos suplementados com glicose, sacarose, celobiose e bagaço de cana pré- tratado por explosão a vapor como únicas fontes de carbono, com o objetivo de testar a capacidade de fermentação de Dekkera/Brettanomyces bruxellensis como uma linhagem industrial de levedura promissora. Como resultado, verificou-se (pela primeira vez em condições de aerobiose restrita) que a linhagem de Dekkera/Brettanomyces bruxellensis GDB 248 poderia produzir etanol a partir de celobiose. Além disso, foi confirmada a atividade celobiásica (β-glicosidase) em extratos semi-purificados caracterizando-a como uma enzima candidato. Foi demonstrado que a linhagem GDB 248 apresentou capacidade de produzir uma concentração de ácido acético maior que o etanol e glicerol, o que confirma a ausência de efeito Custer com esta estirpe em condições de aerobiose restrita. Por outro lado, também se sugere que D. bruxellensis, apesar de se apresentar como competidora no ambiente industrial com Saccharomyces cerevisiae pode-se apresentar como benéfica para a fermentação. Contudo, confirmou-se que D. bruxellensis GDB 248 tem o potencial para produzir etanol a partir de celobiose e se caracteriza como uma linhagem promissora para a fermentação de substratos lenhocelulósicos.

43 INTRODUÇÃO

Recentemente, tem sido demonstrado que a levedura Dekkera/Brettanomyces

bruxellensis tem o potencial para fermentar a sacarose a partir do caldo de cana-de-açúcar

(Saccharum sp) (Pereira, Bassi et al., 2012; Leite, Basso et al., 2013). Bem adaptada aos processos de produção industrial (De Souza Liberal, Basilio et al., 2007), essa levedura pode ser utilizada para a produção de etanol combustível. Além disso, outra característica importante é a capacidade de assimilar celobiose, um dissacarídeo produzido pela hidrólise parcial de celulose. Esta capacidade é de grande importância na produção de etanol a partir de hidrolisados de bagaço, haja visto que esses resíduos, que podem ser metabolizados, são inacessíveis à fermentação por Saccharomyces cerevisiae (Blomqvist, South et al., 2011). A fermentação celobiose já foi evidenciada em D. bruxellensis, no entanto, esta capacidade não é característica em todas as cepas da espécie (Blondin et al., 1982; Spindler et al. 1992; Blomqvist et al. 2010; Galafassi et al. 2011).

Duas características metabólicas bastante citadas da levedura D. bruxellensis são: a sua capacidade para produzir o ácido acético a partir de glicose, apesar de isso só ser evidenciado apenas sob condições aeróbias (Leite, Basso et al., 2013) e o efeito Custer, caracterizado pela inibição temporária da fermentação sob condições anaeróbicas (Scheffers, 1979; Wijsman, Van Dijken et al., 1984). Em alguns trabalhos, sugere-se que

D. bruxellensis não é capaz de produzir glicerol (Wijsman, Van Dijken et al., 1984;

Gerós, Azevedo et al., 2000). No entanto, o grupo do Núcleo Interdepartamental de Engenharia Metabólica da Universidade Federal de Pernambuco associados a outros trabalhos que demonstraram que pequenas quantidades de glicerol são produzidas por esta levedura (Pereira et a., 2012; Leite et al. 2013). Em geral, as leveduras produzem glicerol para corrigir o desequilíbrio no potencial redox, em condições de crescimento anaeróbio ou em condição restrita de demanda de oxigênio (Van Dijken e Scheffers, 1986).

Também foi demonstrado que a linhagem D. bruxellensis GDB 248 é capaz de assimilar celobiose quando o oxigênio é fornecido por agitação (Leite et al. 2013). Em uma continuação deste trabalho, demonstra-se agora que esta D. bruxellensis GDB 248 também pode fermentar celobiose em condições de aerobiose restrita, além da identificação e caracterização parcial da atividade celobiásica (β-glicosidase, EC

44 3.2.1.21) e o gene que a codifica. Há também uma discussão sobre as vantagens e limitações do uso biotecnológico desta levedura para produção de etanol de segunda geração.

MÉTODOS

Levedura

A linhagem de Dekkera bruxellensis GDB 248, que é utilizada no presente estudo, é uma estirpe selvagem isolada a partir do processo industrial de produção de bioetanol de primeira geração (de Souza Liberal et al. 2005). As colônias da cepa foram mantidas por repiques consecutivos em placas de YPD-ágar.

Hidrólise do bagaço

Bagaço de cana-de-açúcar foi pré-tratado por explosão à vapor e suspendido em tampão Tris-Acetato 100 mM pH 4.5 para 20 g/L e hidrolisado enzimaticamente com uma preparação comercial Fibrenzyme™ LWT (Dyadic International Inc., Jupiter, USA), com 40 FPU/g de enzima para cada 2 % m/v de bagaço, à 50ºC por 72 h sob agitação baixa. O hidrolisado foi centrifugado a 1,200 x g por 5 minutos e o sobrenadante foi utilizado para os ensaios de fermentação. A composição dos açúcares totais presentes nas amostras foi avaliada por HPLC (como descrito a diante).

Ensaios de cultivo

As células de levedura foram desenvolvidas em caldo de YPD a 30ºC e 150 rpm por 24 h. Depois, as células foram centrifugadas a 4,500 x g por 10 min e então usadas para inoculação em uma etapa seguinte. Fermentações que simularam condições industriais foram conduzidas com 10% (m/v) de biomassa celular, em meio sintético YNB completo (1.7 g/L) contendo sacarose (25 g/L) (SMsuc), celobiose (SMcello) (20.5 g/L) ou uma mistura de celobiose e glicose (SMcello/glu) (10 g/L cada), bem como em hidrolisado de bagaço de cana-de-açúcar (SMbag) (4.45 g/L celobiose, 9.43 g/L glicose, 8.15 g/L xilose) a 30ºC por diferentes períodos. Foi mantida uma baixa agitação a 120 rpm, apenas para evitar a sedimentação das células.

45 Extrato proteico e atividade celobiásica (β-glicosidase)

Células de leveduras foram cultivadas em meio sintético (1.7 g/L YNB) completo contendo celobiose a 1 g/L até atingir uma densidade óptica de 0.6 A600nm e depois diluiu- se 1:1000 para um volume de 250 mL em meios sintéticos contendo glicose, celobiose ou sacarose a 1.0 g/L. Os frascos foram incubados por 24 h a 33°C e 130 rpm numa incubadora com agitação orbital do tipo “shaker”. Em seguida, as células foram separadas por centrifugação e ressuspendidas em 250 mL do meio de cultivo correspondente (como descrito acima). Este processo foi repetido quatro vezes e após o último ciclo a densidade celular foi determinada (Leite, Basso et al., 2013).

Todas as células foram coletadas por centrifugação a 3,800 x g e 4°C por 30 min. O precipitado foi ressuspendido com dois volumes de tampão acetato 10mM pH 4 contendo 1 mM β-mercaptoetanol e as células foram lisadas por maceração em nitrogênio líquido. O extrato obtido foi centrifugado a 21,000 x g por 15 minutos a 4ºC e o sobrenadante coletado para os experimentos seguintes. A concentração de proteínas totais foi determinada pelo método Comassie® Blue. A reação enzimática foi realizada misturando-se 100 µg de proteínas do extrato bruto e a solução de açúcar foi diluída em tampão acetato de sódio 100mM pH 4.8 para o volume final de 1 mL. A reação foi incubada por 10 minutos a 37°C e foi parada transferindo os tubos para um banho de gelo. A concentração de glicose liberada foi medida com o auxílio de um kit de glicose-oxidase (LabLabor, Brasil). A atividade específica foi expressa como a quantidade de glicose liberada em μmol por minuto a partir um miligrama de proteína obtida de um grama de biomassa celular úmida. Para testar a presença de enzimas extracelulares, foram utilizados os sobrenadantes de culturas de sacarose ou celobiose em reações enzimáticas.

Purificação da Celobiase (β-glicosidase)

Para obter os extratos proteicos, as células de levedura foram cultivadas em meio sintético completo com celobiose como única fonte de carbono, logo depois foram lisadas e submetidas a um fracionamento com sulfato de amônio a partir de 0% a 60% de saturação. O precipitado foi ressuspendido em tampão citrato de sódio 100 mM pH 5 e posteriormente dialisado contra água deionizada com objetivo de dessalinizar as frações proteicas (Bollag, Edelstein et al., 1996). As frações proteicas foram testadas para atividade β-glicosidase usando o substrato cromogênico p-nitrofenil-β-D-

46 glicopiranosídeo (pNPG). As frações que apresentavam atividade enzimática foram reunidas (fração EF1) e então submetidas à cromatografia de exclusão molecular em colunas contendo matriz Sephadex® G75 (26 mm de diâmetro, 10 cm de altura, equilibradas com tampão citrato-fosfato 100 mM pH 5 a um fluxo de 6 mL/h). As frações eluídas contendo atividade β-glicosidase foram reunidas e submetidas à cromatografia de troca iônica em CM-celulose (15 mm de diâmetro, 10 cm de altura, equilibrada com tampão citrato-fosfato 10 mM pH 3.8 a um fluxo 10 mL/h). As proteínas ligadas à matriz foram eluídas com uma solução de NaCl a 0.5 M a fluxo de 10 mL/h e as frações contendo atividade β-glicosidase foram novamente reunidas (fração EF2). A pureza das proteínas foi verificada por eletroforese em SDS-PAGE em 12% de gel de acrilamida. Uma isoeletrofocalização foi realizada para determinar o ponto isoelétrico da proteína isolada. Uma eletroforese 2D utilizando fitas de gradiente de pH imobilizados (Immobiline™ DryStrip Gels, GE Healthcare) com amplitudes de pH que variaram entre 3 a 10 foi equilibrada por 30 min com solução contendo DTT 6.5 mM e IAA 134 mM e então o extrato proteico foi submetido a uma pré-corrida eletroforética a 200 V (2 mA) por duas horas, seguida pela corrida a 3,500 V (2mA) por 1.25 h. As fitas, depois, foram usadas para uma separação por eletroforese de segunda dimensão em gel de poliacrilamida 12% e revelada por coloração com Comassie® Blue.

Ensaios de cinética enzimática

O ensaio de especificidade do substrato para dissacarídeos foi determinada (como descrito acima). O perfil cinético da fração EF2 foi avaliada utilizando pNPG como substrato. As reações foram padronizadas usado um volume de enzima contendo 100 μg de proteína, de um volume igual de solução de pNPG 100mM e tampão citrato de sódio 100 mM pH 4,8 para um volume final de 1 mL. As reações foram incubadas a 37ºC durante 10 minutos e interrompida pela adição de 100 mL de solução de bicarbonato de sódio 1M e a cor amarela, indicativa de libertação pNP foi quantificada a 410 nm. Uma curva padrão foi preparada com pNP correlacionar -se a absorvância com a quantidade de produto vaporizado e a atividade específica foi calculada como a quantidade de enzima que produziu um μmol de pNP por minuto por miligrama de proteína da amostra. O pH ótimo foi avaliado usando tampão de citrato-fosfato ajustado para diferentes valores de pH e as reações foram incubadas a 30ºC durante 10 minutos. Ao testar a temperatura ótima de atividade celobiásica, o pH foi ajustado para 4,0 e as reações foram incubadas a

47 diferentes temperaturas durante 10 minutos. A estabilidade térmica da enzima foi analisada por incubação com fração EF2 durante 10 minutos a temperaturas que variam de 20ºC a 60ºC. Posteriormente, a preparação de enzima foi deixada à temperatura ambiente (25ºC) durante 10 minutos e em seguida, utilizada para avaliar a atividade da enzima utilizando pNPG a pH e temperatura ótimos. A taxa de conversão máxima (Vmáx) e constante de afinidade (km) foram calculados a partir de da projeção do duplo recíproco no gráfico de Lineweaver-Burk variando a concentração de pNPG nas reações, que também foi utilizada para calcular a constante catalítica (kcat) da enzima parcialmente purificada. A inibição da atividade foi medida pela adição de dissacarídeos ou pNPGal a 10 mM em reações contendo pNPG e expressa como a percentagem de pNP produzido. Todas estas medições foram realizadas ao pH e temperatura ideais.

Análises de açúcares e principais produtos metabólicos

As concentrações de etanol, acetato, sacarose, glicose e celobiose nas amostras coletadas de fermentação foram determinadas por HPLC (Cromatografia Líquida de Alta Performance) composto por um sistema Agilent 120039, um injetor automático, um detector nas faixas de comprimento de onda no infravermelho e ultravioleta e uma coluna de troca catiônica AMINEX HPX-87H (Bio-Rad, USA), precedida de uma pré-coluna micro-Guard (Bio-Rad). A fase móvel usada foi de ácido sulfúrico 5 mM a um fluxo de 0.6 mL/min. A temperatura do forno foi de 70°C. O volume de amostra injetado foi de 20µL. Os compostos foram identificados a partir dos seus tempos de retenção relativos e quantificados diretamente a partir de uma curva padrão com diluição seriada. Os valores representam, pelo menos, a média de duas réplicas biológicas.

Identificação genética e análise in silico

Pesquisas por meio de palavras-chave como hidrolase, amilase, amiloglicosidase e glicosidase foram realizadas na base de dados genômicos de D. bruxellensis (http://www.lge.ibi.unicamp.br/dekkera/) e as sequências de nucleotídeos dos contigs recuperados foram usados para análise no BLASTx do GenBank. O contig de D.

bruxellensis que apresentou maior semelhança com os genes de codificação da β -

48 A sequência parcial da proteína β-glicosidase foi utilizada para a análise em BLASTp na