Delineamento do estudo

Devido a complexidade e ao grande número de fatores que se objetivou analisar neste trabalho, entendemos que para uma melhor compreensão deste, o estudo deva ser dividido em dois sub projetos: Estudo da interação dos hormônios sexuais e da vitamina K no metabolismo osteomineral (Estudo 1 – item 5.1); Estudo da interação da ApoE e dos hormônios sexuais no metabolismo osteomineral (Estudo 2 – item 5.7).

4.2.1 Estudo da interação dos hormônios sexuais e da vitamina K no metabolismo osteomineral

Alguns estudos têm mostrado a relação entre a suplementação de vitamina K e o estado hormonal de pacientes acometidos pela osteoporose (KANEKI et al., 2006; HEISS et al, 2008; LANHAM-NEW, 2008; BINKLEY et al, 2009; IWAMOTO et al., 2009). Contudo, muito do entendimento desta interação se deve ao uso de modelos animais, principalmente ratas ovariotectomizadas (AKIYAMA et al, 1993; HARA et al., 1994; AKIYAMA et al., 1999; BINKLEY et al., 2002; KOBAYASHI, HARA & AKIYAMA, 2002). Portanto, neste trabalho utilizamos protocolos semelhantes àqueles descritos na literatura. Segue abaixo um esquema do curso temporal com os pontos de intervenção (Figura 6) das atividades realizadas desde a ovariotectomia e suplementação com vitamina K, até o sacrifício dos animais. Esta organização deve auxiliar no entendimento das datas em que foram realizadas as

atividades de ovariotectomia, densitometria, início dos tratamentos, coleta de urina e sacrifício.

Figura 6 - Linha do tempo que apresenta as principais atividades realizadas, desde a primeira

densitometria (dia 0) até o sacrifício (dia 116)

Foram utilizados vinte camundongos fêmeas C57 Black 6 (Mus musculus) com seis meses de vida, mantidos em gaiolas em temperatura controlada e alimentados com ração e água/água e vitamina K3 (VK3) ad libitum, fornecidos pelo biotério do Laboratório de Transgenes e Controle Cardiovascular (LTCC) – responsabilidade da Dr.ª Silvana dos Santos Meyrelles. O esquema inicia-se com a primeira densitometria (dia 0 – para estabelecer a DMO basal). No 13o dia após a primeira DMO foram concluídas as OVX. Cumpre ressaltar que entre os dias 0 e 12, realizaram-se outras duas outras densitomerias para estabelecimento da linha basal (não mostrado). Após 32 dias da OVX, foi iniciado tratamento com 100 mg/dia/kg de vitamina K do animal, através da ingestão na água de beber. O acompanhamento da DMO foi feita através de análise densitométrica nos dia 50o, 70o, 105o e sacrifício no dia 116. Ao sacrifício, sangue, urina, órgãos e tecidos foram retirados e estocados de acordo com o objetivo experimental a ser alcançado. Foram então utilizados quatro grupos, a saber: C57Bl6 SHAM operado (também chamado de selvagem ou wild type (WT) ou controle; C57Bl6 ovariotectomizado (OVX) – ambos sem

suplementação de vitamina K; C57SHAM e C57OVX, ambos com suplementação de vitamina K. Ao final do tratamento, três camundongos de cada grupo foram alocados separadamente em gaiolas metabólicas (Instrulab. Brasil), para coleta de urina de 24 horas. Posteriormente os animais foram sacrificados por injeção de tiopental 40 mg/Kg (Thiopentax – Crisália – Brasil). Foram retirados o útero e os fêmures, além do sangue, através de punção cardíaca. Todos os animais foram pesados em balança digital imediatamente antes do procedimento cirúrgico para quantificação correta da dosagem anestésica. Também foram separados: o fígado, o coração o cérebro, o baço e os pulmões; todos colocados em solução de glutaraldeído. Para visualizarmos alguma alteração ultraestrutural no tecido ósseo retiramos amostras dos fêmures dos diferentes grupos experimentais para submetermos ao Microscópio Eletrônico de Varredura (MEV). Para melhor compreensão do desenho experimental ver Figura 7.

Figura 7 – Esquema do experimento envolvendo a ovariotectomia nos camundongos C57Bl6 e APOEKO.

OVX VK (APOEKO OVX)

SHAM (C57 WT) OVX (ApoEKO)

SHAM CTRL (C57 WT SHAM) SHAM VK (C57 OVX) OVX CTRL (APOEKO SHAM)

4.2.2 Estudo da interação dos hormônios sexuais e com a ApoE no metabolismo osteomineral

Como dito anteriormente, a ApoE tem sido apontada como agente regulador da DMO. Outros relatos apontam que outros fatores podem modular o efeito da ApoE no metabolismo ósseo (ZMUDA et al., 1999). No intuito de melhor elucidar esta interação, foram utilizados dez (10) camundongos fêmeas C57 Black 6 (Mus musculus) e dez (10) camundongos de mesmo background genético, mas cujo o gene APOE foi silenciado por recombinação somática (BEDELL, JENKINS & COPELAND, 1997), doravante chamados de APOE knock out (ou APOEKO).Findo o 6º mês, os animais foram distribuídos aleatoriamente em quatro grupos com cinco animais cada. Metade dos animais foi submetida à ovariotectomia bilateral (grupo OVX). A outra metade foi falsamente ovariotectomizada, constituindo o grupo SHAM. Cumpre ressaltar que os mesmos procedimentos cirúrgicos foram também executados nos animais C57Bl6 controle. Para os procedimentos cirúrgicos os animais foram anestesiados com a associação de 100 mg/kg de quetamina e 10 mg/kg de xilazina. Foi feita a tricotomia da região abdominal. A pele e a musculatura foram incisadas longitudinalmente e os ovários foram identificados e expostos. No caso do grupo OVX, foi feita a excisão dos ovários com sua gordura circundante, das tubas uterinas e de uma pequena porção do útero. A hemostasia foi feita através da ligação, com fio de nylon (Shalon Fios Cirúrgicos – Brasil), na porção superior da tuba uterina. Suturou-se a pele e a camada muscular com fio de sutura absorvível, categute (Shalon Fios Cirúrgicos – Brasil). No grupo SHAM, após a exposição dos ovários, procedeu-se a manipulação e recolocação na cavidade abdominal dos mesmos, tudo objetivando a simulação de um estresse cirúrgico; foi feita a sutura da cavidade abdominal. Ao fim das cirurgias, os camundongos foram mantidos por 60 dias em gaiolas individuais. Cada um dos camundongos foi então alocado em gaiolas metabólicas (Instrulab, Brasil) Um esquema da estratégia experimental é mostrado na FIGURA 7. Determinamos então os seguintes grupos: C57Bl6 SHAM operado (também chamado de selvagem ou I wild type (WT) ou controle; C57Bl6 ovariotectomizado (OVX); APOEKO SHAM; APOEKO OVX. Após dois meses, cada animal de cada grupo foi alocado em gaiolas metabólicas (Instrulab, Brasil) para coleta de urina de 24h. No dia seguinte, os animais foram sacrificados por overdose de tiopental (Thiopentax – Crisália – Brasil). O sangue foi coletado por punção cardíaca e os órgãos e tecidos de interesse foram retirados processados de acordo

com o objetivo a ser alcançado. Para análises histoquímicas os tecidos foram fixados em solução de paraformaldeido a 4% e glutaraldeído a 2,5%. Foram retirados pequenos fragmentos de fêmures dos grupos ApoEKO/SHAM e ApoEKO/OVX para visualização no MEV e MET.