1.3 Hipótese
3.2.6 Delineamento experimental
Etapa 1: Avaliação do efeito dos ligantes do receptor NOP sobre o comportamento de ansiedade em camundongos submetidos ao LCE
Experimento 1:
Esses experimentos foram realizados com camundongos Swiss, no Laboratório de Farmacologia Comportamental, na UFRN.
Inicialmente, o protocolo experimental da tarefa do LCE foi padronizado nas condições experimentais deste laboratório, utilizando o diazepam. Em
seguida, foram avaliados os efeitos dos ligantes peptídicos do receptor NOP: N/OFQ (agonista endógeno), UFP-113 e [F/G]N/OFQ(1-13)NH2 (agonistas parciais). Para tanto, os camundongos foram aleatoriamente divididos nos seguintes grupos:
1. Veículo (ip) 30 min antes do teste;
2. Diazepam (1 mg/kg, ip) 30 min antes do teste; 3. Salina (icv) 5 min antes do teste;
4. N/OFQ (0,1 nmol, icv) 5 min antes do teste;
5. UFP-113 (0,01, 0,03, 0,1 e 1 nmol, icv) 5 min antes do teste; 6. [F/G]N/OFQ(1-13)NH2 (0,1, 0,3, 1 e 3 nmol, icv) 5 min antes do teste.
O tempo de tratamento de cinco minutos é comumente utilizado em administrações icv de peptídeos (Gavioli et al., 2003; Gavioli et al., 2004). A dose de N/OFQ foi determinada com base em estudos prévios, que mostraram que essa dose é capaz de induzir o efeito do tipo ansiolítico em camundongos (Gavioli & Calo', 2006; Jenck et al., 1997). As doses de UFP-113 e [F/G]N/OFQ(1-13)NH2 foram escolhidas com base em estudos prévios realizados in vitro e in vivo (Arduin et al., 2007; Calo' et al., 2000b).
Figura 6: Fluxograma ilustrativo do experimento 1 da etapa 1.
Experimento 2:
Esses experimentos foram realizados com camundongos CD-1, no 30 min 5 dias 5 min LCE Administração icv N/OFQ UFP-113 [F/G]N/OFQ(1-13)NH2 Administração ip Diazepam Cirurgia estereotáxica Swiss
Departamento de Ciências Médicas da Università degli Studi di Ferrara (Itália). Novamente, o protocolo experimental da tarefa do LCE foi padronizado nas condições experimentais deste laboratório usando o diazepam. Em seguida, foram avaliados os efeitos dos ligantes não peptídicos do receptor NOP: Ro 65-6570 (agonista) e AT-090 (agonista parcial). Para tanto, os camundongos foram aleatoriamente divididos nos seguintes grupos:
1. Veículo (ip) 30 min antes do teste;
2. Diazepam (1 mg/kg, ip) 30 min antes do teste;
3. Ro 65-6570 (0,01, 0,03 e 0,1 mg/kg, ip) 30 min antes do teste; 4. AT-090 (0,001, 0,003, 0,01 e 0,03 mg/kg, ip) 30 min antes do teste.
As doses de Ro 65-6570 foram determinadas com base em estudos prévios (Röver et al., 2000).
Figura 7: Fluxograma ilustrativo do experimento 2 da etapa 1.
Experimento 3:
Esses experimentos foram realizados no Departamento de Ciências Médicas da Università degli Studi di Ferrara (Itália).
A seletividade de ação do Ro 65-6570 e do AT-090 foram avaliadas por meio da administração desses compostos em camundongos NOP(-/-) e seus controles NOP(+/+). Para tanto, os camundongos foram aleatoriamente divididos nos seguintes grupos:
1. NOP(+/+): veículo (ip) 30 min antes do teste;
2. NOP(+/+): diazepam (1 mg/kg, ip) 30 min antes do teste; 3. NOP(+/+): Ro 65-6570 (0,1 mg/kg, ip) 30 min antes do teste;
30 min LCE Administração ip Diazepam Ro 65-6570 AT-090 CD-1
4. NOP(+/+): AT-090 (0,01 mg/kg, ip) 30 min antes do teste; 5. NOP(-/-): veículo (ip) 30 min antes do teste;
6. NOP(-/-): diazepam (1 mg/kg, ip) 30 min antes do teste; 7. NOP(-/-): Ro 65-6570 (0,1 mg/kg, ip) 30 min antes do teste; 8. NOP(-/-): AT-090 (0,01 mg/kg, ip) 30 min antes do teste.
Figura 8: Fluxograma ilustrativo do experimento 3 da etapa 1.
Etapa 2: Avaliação dos ligantes do receptor NOP sobre atividade locomotora dos camundongos expostos ao campo aberto
Esses experimentos foram realizados com camundongos Swiss, no Laboratório de Farmacologia Comportamental, na UFRN.
Foram avaliados os efeitos dos agonistas parciais peptídicos do receptor NOP, UFP-113 e [F/G]N/OFQ(1-13)NH2, sobre a atividade locomotora dos camundongos, uma vez que esses compostos pareceram induzir sedação nas altas doses testadas no LCE. Para tanto, os camundongos foram aleatoriamente divididos nos seguintes grupos:
1. Salina (icv) 5 min antes do teste;
2. UFP-113 (0,01, 0,03, 0,1 e 1 nmol, icv) 5 min antes do teste; 3. [F/G]N/OFQ(1-13)NH2 (0,1, 0,3, 1 e 3 nmol, icv) 5 min antes do teste.
Figura 9: Fluxograma ilustrativo do experimento 2.
5 dias 5 min Campo
aberto Administração icv UFP-113 [F/G]N/OFQ(1-13)NH2 Cirurgia estereotáxica Swiss 30 min LCE Administração ip Diazepam Ro 65-6570 AT-090 NOP(+/+) NOP(-/-)
Etapa 3: Avaliação do efeito dos ligantes do receptor NOP sobre o comportamento do tipo depressivo em camundongos expostos ao TNF
Experimento 1:
Esses experimentos foram realizados com camundongos Swiss, no Laboratório de Farmacologia Comportamental, na UFRN.
Inicialmente, o protocolo experimental do TNF foi padronizado nas condições experimentais deste laboratório utilizando a nortriptilina. Em seguida, foram avaliados os efeitos dos ligantes peptídicos do receptor NOP: UFP-101 (antagonista), UFP-113 e [F/G]N/OFQ(1-13)NH2 (agonistas parciais). Para tanto, os camundongos foram aleatoriamente divididos nos seguintes grupos:
1. Veículo (ip) 30 min antes do teste;
2. Nortriptilina (30 mg/kg, ip) 30 min antes do teste; 3. Salina (icv) 5 min antes do teste;
4. UFP-101 (10 nmol, icv) 5 min antes do teste;
5. UFP-113 (0,01, 0,03 e 0,1 nmol, icv) 5 min antes do teste;
6. [F/G]N/OFQ(1-13)NH2 (0,1, 0,3 e 1 nmol, icv) 5 min antes do teste.
A dose de UFP-101 foi determinada com base em estudos prévios, que mostraram que essa dose é capaz de induzir o efeito do tipo antidepressivo em camundongos (Gavioli et al., 2003; Gavioli et al., 2004).
Figura 10: Fluxograma ilustrativo do experimento 1 da etapa 3. 24 h 30 min 5 dias 5 min TNF Teste Administração icv N/OFQ UFP-113 [F/G]N/OFQ(1-13)NH2 Administração ip Nortriptilina Cirurgia estereotáxica Treino TNF
Experimento 2:
Esses experimentos foram realizados com camundongos Swiss, no Laboratório de Farmacologia Comportamental, na UFRN.
A seletividade de ação do UFP-113 e do [F/G]N/OFQ(1-13)NH2 foram avaliadas por meio da administração desses compostos após o pré-tratamento com a N/OFQ. Para tanto, os camundongos foram aleatoriamente divididos nos seguintes grupos:
1. Veículo (icv) + veículo (icv);
2. N/OFQ (1 nmol, icv) + veículo (icv); 3. Veículo (icv) + UFP-113 (0,1 nmol, icv);
4. N/OFQ (1 nmol, icv) + UFP-113 (0,1 nmol, icv); 5. Veículo (icv) + [F/G]N/OFQ(1-13)NH2 (1 nmol, icv);
6. N/OFQ (1 nmol, icv) + [F/G]N/OFQ(1-13)NH2 (1 nmol, icv).
Os camundongos receberam N/OFQ (1 µl, icv) 5 min da administração de UFP-113 ou [F/G]N/OFQ(1-13)NH2 (1 µl, icv). Cinco minutos após a administração de UFP-113 ou [F/G]N/OFQ(1-13)NH2 os camundongos foram submetidos a sessão de teste do TNF.
Figura 11: Fluxograma ilustrativo do experimento 2 da etapa 3.
Experimento 3:
Esses experimentos foram realizados com camundongos CD-1, no Departamento de Ciências Médicas da Università degli Studi di Ferrara (Itália).
Novamente, o protocolo experimental do TNF foi padronizado nas
24 h 5 min 5 dias 5 min TNF Teste Adm icv N/OFQ Cirurgia estereotáxica Adm icv UFP-113 [F/G] TNF Treino
condições experimentais deste laboratório usando a nortriptilina. Em seguida, foram avaliados os efeitos dos ligantes não peptídicos do receptor NOP: SB- 612111 (antagonista), Ro 65-6570 (agonista) e AT-090 (agonista parcial). A fim de excluir a influência da limitação farmacocinética do AT-090 nos resultados (uma vez que esse composto foi administrado por via ip), apesar de ser de natureza não peptídica, esse composto foi também administrado icv. Para tanto, os camundongos foram aleatoriamente divididos nos seguintes grupos:
1. Veículo (ip) 30 min antes do teste;
2. Nortriptilina (20 mg/kg, ip) 30 min antes do teste; 3. SB-612111 (10 mg/kg, ip) 30 min antes do teste; 4. Ro 65-6570 (0,1 mg/kg, ip) 30 min antes do teste;
5. AT-090 (0,001, 0,003, 0,01, 0,03 e 0,1 mg/kg, ip) 30 min antes do teste;
6. Veículo (icv) 15 min antes do teste;
7. AT-090 (0,001 e 0,01 nmol, icv) 15 min antes do teste.
Figura 12: Fluxograma ilustrativo do experimento 3 da etapa 3.
Etapa 4: Avaliação dos efeitos dos ligantes do receptor NOP sobre o comportamento de hiperlocomoção induzida pelo metilfenidato
Experimento 1:
Toda essa série experimental foi realizada em camundongos Swiss, no Laboratório de Farmacologia Comportamental, na UFRN.
24 h 30 min 15 min TNF Teste Administração icv AT-090 Administração ip Nortriptilina SB-612111 Ro 65-6570 AT-090 TNF Treino CD-1
Inicialmente, o protocolo experimental do teste da HIM foi padronizado nas condições experimentais. Para tanto, o metilfenidato foi utilizado para induzir a hiperlocomoção e o valproato de sódio foi usadao para reverter a hiperlocomoção induzida pelo metilfenidato. Os camundongos foram aleatoriamente divididos nos seguintes grupos:
1. Veículo (ip) + veículo (sc);
2. Veículo (ip) + metilfenidato (10 mg/kg, sc);
3. Valproato de sódio (400 mg/kg, ip) + veículo (sc);
4. Valproato de sódio (400 mg/kg, ip) + metilfenidato (10 mg/kg, sc).
Os camundongos receberam valproato de sódio (ou veículo, ip) 30 min antes da administração de metilfenidato (ou veículo, sc). Quinze minutos após a administração de metilfenidato, os camundongos foram submetidos ao campo aberto por 30 min.
Figura 13: Fluxograma ilustrativo do experimento 1 da etapa 4.
Experimento 2:
Esses experimentos foram realizados com camundongos Swiss, no Laboratório de Farmacologia Comportamental, na UFRN.
Uma vez encontrada as condições experimentais adequadas, foram avaliados os efeitos dos ligantes peptídicos do receptor NOP: N/OFQ (agonista), UFP-101 (antagonista), UFP-113 e [F/G]N/OFQ(1-13)NH2 (agonistas parciais) na hiperlocomoção induzida pelo metilfenidato. Para tanto, os camundongos foram aleatoriamente divididos nos seguintes grupos experimentais:
1. Veículo (icv) + veículo (sc);
30 min 15 min Campo
aberto Administração sc Metilfenidato Administração ip Valproato Swiss
2. Veículo (icv) + metilfenidato (10 mg/kg, sc); 3. N/OFQ (1 nmol, icv) + veículo (sc);
4. N/OFQ (1 nmol, icv) + metilfenidato (10 mg/kg, sc); 5. UFP-101 (10 nmol, icv) + veículo (sc);
6. UFP-101 (10 nmol, icv) + metilfenidato (10 mg/kg, sc); 7. UFP-113 (0,01, 0,03 e 0,1 nmol, icv) + veículo (sc);
8. UFP-113 (0,01, 0,03 e 0,1 nmol, icv) + metilfenidato (10 mg/kg, sc);
9. [F/G]N/OFQ(1-13)NH2 (0,1, 0,3 e 1 nmol, icv) + veículo (sc);
10. [F/G]N/OFQ(1-13)NH2 (0,1, 0,3 e 1 nmol, icv) + metilfenidato (10 mg/kg, sc).
Os camundongos receberam os ligantes peptídicos do receptor NOP (ou veículo, icv) cinco minutos antes da administração de metilfenidato (ou veículo, sc). Quinze minutos após a administração de metilfenidato, os camundongos foram submetidos ao campo aberto por 30 min.
Figura 14: Fluxograma ilustrativo do experimento 2 da etapa 4.
Experimento 3:
Esses experimentos foram realizados com camundongos CD-1, no Departamento de Ciências Médicas da Università degli Studi di Ferrara (Itália).
Foram avaliados os efeitos dos ligantes não peptídicos do receptor NOP: SB-612111 (antagonista) e AT-090 (agonista parcial) sobre a hiperlocomoção induzida pelo metilfenidato. Para tanto, os camundongos foram aleatoriamente
5 min 15 min Campo
aberto Administração sc Metilfenidato Administração icv N/OFQ UFP-101 UFP-113 [F/G]N/OFQ(1-13)NH2 Swiss
divididos nos seguintes grupos: 1. Veículo (ip) + veículo (sc);
2. Veículo (ip) + metilfenidato (10 mg/kg, sc); 3. SB-612111 (10 mg/kg, ip) + veículo (sc);
4. SB-612111 (10 mg/kg, ip) + metilfenidato (10 mg/kg, sc); 5. AT-090 (0,001, 0,01 e 0,03 mg/kg, ip) + veículo (sc);
6. AT-090 (0,001, 0,01 e 0,03 mg/kg, ip) + metilfenidato (10 mg/kg, sc);
Os camundongos receberam os ligantes não peptídicos do receptor NOP (ou veículo, ip) 30 min antes da administração de metilfenidato (ou veículo, sc). Quinze minutos após a administração de metilfenidato, os camundongos foram submetidos ao campo aberto por 30 min.
Figura 15: Fluxograma ilustrativo do experimento 3 da etapa 4.
Experimento 4:
Toda essa série experimental foi realizada com camundongos nocautes para o receptor NOP (NOP(-/-)) e seus respectivos controles (NOP(+/+)), no Departamento de Ciências Médicas da Università degli Studi di Ferrara (Itália).
Esse experimento foi realizado a fim de avaliar o fenótipo dos animais NOP(-/-) e NOP(+/+) no teste da HIM, e a fim de avaliar a seletividade de ação do agonista parcial do receptor NOP, UFP-113. Para tanto, os camundongos foram divididos nos seguintes grupos experimentais:
1. NOP(+/+): veículo (icv) + veículo (sc);
2. NOP(+/+): veículo (icv) + metilfenidato (10 mg/kg, sc); 3. NOP(+/+): UFP-113 (0,1 nmol, icv) + veículo (sc);
15 min 30 min Campo aberto Administração sc Metilfenidato Administração ip SB-612111 AT-090 CD-1
4. NOP(+/+): UFP-113 (0,1 nmol, icv) + metilfenidato (10 mg/kg, sc); 5. NOP(-/-): veículo (icv) + veículo (sc);
6. NOP(-/-): veículo (icv) + metilfenidato (10 mg/kg, sc); 7. NOP(-/-): UFP-113 (0,1 nmol, icv) + veículo (sc);
8. NOP(-/-): UFP-113 (0,1 nmol, icv) + metilfenidato (10 mg/kg, sc);
Figura 16: Fluxograma ilustrativo do experimento 4 da etapa 4.