Delineamento experimental

subcutânea, 25 cercárias por animal, conforme detalhado por Pellegrino e Macedo

(1955).

Após a infecção experimental, os animais infectados e seus controles foram

acompanhados por 8 e 14 semanas para avaliação mortalidade, carga parasitária,

patologia e resposta imulógica. Foram realizadas comparações apenas entre

camundongos do mesmo sexo e infectados com o mesmo lote de cercárias no intuito de

evitar variações dependentes desta variável.

4.2 Delineamento experimental

Antes do inicio do experimento, todos os animais utilizados foram submetidos

ao tratamento oral com 4mg/Kg de Ivermectina (Laboratório Chemitec

Agro-Veterinária, São Paulo, Brasil) por sete dias consecutivos (Klement et al.1996) e com 75

mg/Kg em dose única de Cestox®. (MERCK). No 10º dia após o final do tratamento os

camundongos fêmeas e machos entre 6 a 8 semanas foram separados nos diferentes

grupos experimentais e infectados por S.mansoni, conforme descrito anteriormente. Para

eutanásia e necropsia cada animal foi anestesiado intraperitonealmente com solução de

Ketamina e Xilazina (88 mg/Kg de Dopalen – Sespo Indústria e comércio Ltda, Jacareí,

São Paulo, Brasil e 16 mg/Kg de Kensol – Laboratórios Köing S.A., Avellaneda,

Argentina). Após a anestesia, amostra de sangue de cada animal experimental foi

coletada pelo plexo braquial e, logo em seguida, os animais foram eutanasiados por

deslocamento cervical e necropsiados para quantificação da carga parasitária e avaliação

das alterações imunológicas e patológicas. Para avaliação da carga parasitária os

animais foram inicialmente submetidos à perfusão sanguínea para recuperação dos

vermes adultos e digestão de tecidos para quantificação dos ovos retidos. A perfusão

induz a destruição do arcabouço tecidual e impede que os tecidos destes animais sejam

utilizados para a avaliação de parâmetros histopatológicos. Desta forma, grupos

separados de animais foram utilizados para a avaliação de parâmetros parasitológicos e

imunológicos e histopatológicos. Para confirmar a uniformidade das amostras quanto à

infecção, as coletas de fezes e sangue foram realizadas em todos os animais analisados.

42

Para avaliação parasitológica e imunológica na fase aguda, um total de 26

camundongos Balb/c (WT) e 18 camundongos Balb/c geneticamente deficientes no

receptor de IL-33 (ST2

) foram infectados por 25 cercárias de S.mansoni e 6 animais de

cada grupo foram mantidos não infectado. Após 8 semanas da infecção, 10 animais

ST2

e 14 animais WT foram anestesiados para coletada de sangue e após a eutanasia

foram utilizados para avaliação da carga parasitológica, que constou de coleta de

amostra de fezes para a confirmação de eliminação de ovos do parasito; perfusão

sanguínea para recuperação e contagem dos vermes adultos; digestão tecidual do fígado

(lobo esquerdo), baço, pulmões e intestino delgado e grosso para quantificação da

retenção de ovos nestes órgãos, os demais lobos hepáticos: lobo direito recuperação de

granuloma e o bilobado foi congelado para posterior quantificação de Hidroxiprolina.

No dia seguinte, as fezes foram coletadas dos animais restantes que, posteriormente,

foram anestesiados para coleta de sangue e necropsiados para recuperação do fígado

utilizado para as demais avaliações imunológicas: o lobo bilobado do fígado foi

separado e congelado para quantificação de citocina, atividade enzimática de peroxidase

de eosinófilo (EPO), mieloperoxidase (MPO), o lobo direito hepático foi

homogeneizado para recuperação de granulomas hepáticos, o lobo esquerdo foi

congelado para quantificação de N-acetilcosaminidase (NAG).

Para a análise da taxa de sobrevivência e as alterações da fase crônica da

infecção outro lote de 30 camundongos Balb/c (WT) e 30 camundongos Balb/c

geneticamente deficientes no receptor de IL-33 (ST2

) foram infectados por 25

cercárias de S.mansoni e 8 animais de cada grupo foram mantidos não infectados. Os

eventuais casos de óbitos foram anotados semanalmente e ao final de 14 semanas os

animais foram eutanasiado e necropsiado e seguiu-se da mesma maneira descrita na fase

aguda. Finalmente, para a análise histopatológica foram utilizados 18 camundongos WT

e 18 camundongos ST2

, sendo que 6 animais de cada grupo foram mantidos não

infectados, 6 animais infectados foram eutanasiados e necropsiados durante a fase aguda

e 6 na fase crônica da infecção por S. mansoni. Amostras do tecido hepático de cada

animal foram recolhidas, fixadas e montadas em parafina para as análises

histopatógicas. A figura 2 ilustra o procedimento utilizado os 3 experimentos, por meio

de organograma contendo a fases aguda, crônica e histologia.

43 Figura 2.Organograma experimental para avaliação de carga parasitária, análise bioquímica

(ALT e AST), sorológica, avaliação imunológica e avaliação histopatológica.

Fígado Histologia 88 animais Balb/c WT 70 animais Balb/c ST2 20 animais Balb/c WT 20 animais Balb/c ST2 -/-Eutanásia e Necropsia Fase Aguda(8 semanas) e Fase Crônica(14 semanas)

Perfusão ^{Digestão Fezes Sangue Fígado}

Ovos no baço, pulmão, fígado e intestino OPG _Soro: IgM,IgG, IgG1, IgE, ALT, AST

EPO, MPO e citocina tecido e granuloma, Hidroxiprolina, NAG Infecção por S. mansoni 25 cercárias Observação da mortalidade Vermes

44

4.2.1 Obtenção de antígenos de S. mansoni

Para obtenção de antígenos de vermes adultos (SWAP) de S. mansoni foram

utilizados camundongos Swiss infectados experimentalmente a 45-50 dias com 100

cercárias do parasito, rotineiramente utilizados no laboratório de Esquistossomose para

manutenção do parasito. Para a produção de SWAP, vermes adultos, machos e fêmeas,

foram recuperados por perfusão sanguínea dos animais infectados, realizada conforme

descrição de Pellegrino e Siqueira (1956) e detalhado a seguir. Os vermes recuperados

foram lavados, concentrados e liofilizados e mantidos em dissecador até o momento de

uso. Para a produção de antígeno, os vermes liofilizados são macerados em nitrogênio

liquido e homogeneizados em tampão fosfato (PBS - 137 mM NaCl, 2,7 mM KCl,

4,3mM Na

HPO

.7H

0, 1,4 mM KH

PO

) contendo coquetel de inibidores de proteases

(1 tablete em cada 25 mL de tampão, Boehringer Mannheim, Indianápolis, USA),

conforme descrição detalhada por Dunne et al. (1997).

Para obtenção de antígenos SEA, os ovos de S. mansoni foram obtidos a partir

do fígado dos camundongos após 45-50 dias da infeção por S. mansoni, rotineiramente

utilizados no laboratório de Esquistossomose, conforme metodologia inicialmente

descrita por Pellegrino e Katz (1968) e por Fallon & Dunne (1999) e adaptada pelo

nosso grupo de pesquisa. Sucintamente, fígados de animais infectados foram coletados e

homogeneizados em salina gelada e concentrada (2 % de NaCl) por 2 minutos em

liquidificador na menor velocidade. A seguir, o homogenato foi passado através da

malha de filó (os debris retidos foram eliminados) e o material filtrado foi decantado em

cálice de 2L, em banho de gelo ou na geladeira, por 35 minutos para que os ovos se

depositem no fundo. Passado esse período o sobrenadante foi aspirado, tomando o

cuidado de deixar no fundo do cálice uma margem segura do homogenato com os ovos,

e em seguida o sedimento foi ressuspendido em solução salina concentrada e gelada.

Esse procedimento foi repetido até a obtenção de um sobrenadante limpo. Após as

lavagens, o sedimento contendo os ovos do parasito foi filtrado em peneiras de análise

granulométrica de modo sequencial; inicialmente a solução foi filtrada em peneira Tyler

150 de abertura 106 mm/µm, na qual ficam retido sedimentos maiores, e posteriormente

o material recolhido foi passado em peneira Tyler 400 de abertura 38 mm/µm, que

retém a maioria dos ovos de S. mansoni. Os ovos retidos na peneira são recuperados e o