DELINEAMENTO EXPERIMENTAL

3.2.1 Procedimento cirúrgico

Previamente à realização do procedimento cirúrgico, os animais foram anestesiados, por via inalatória, em cuba contendo algodão embebido em halotano, de acordo com as orientações do Conselho Federal de Medicina Veterinária, para protocolos experimentais com roedores (CFMV¹ – 2002). Em seguida ao estabelecimento do plano

1 Conselho Federal de Medicina Veterinária

anestésico, os animais foram posicionados em decúbito ventral para que fosse feitas a tricotomia e anti-sepsia do campo operatório; para a anti-sepsia utilizaram-se álcool iodado e gazes estéreis.

Concebeu-se a confecção das feridas cirúrgicas na região cérvico dorsal por ser considerada uma área de difícil acesso ao animal, minimizando ou evitando o autoferimento.

As lesões cirúrgicas foram obtidas com o auxílio de um saca-bocado com diâmetro de 10 mm, baseando-se em protocolo proposto por Ribeiro et al. (2003). O saca-bocado foi posicionado perpendicularmente na região pré-estabelecida e a solução de continuidade cutânea obtida com a execução de movimento giratório, com leve pressão (Figura 1).

Figura 1 – Imagem fotográfica da confecção da ferida cirúrgica experimental, com saca-bocada de 10 mm, na região cérvico dorsal de ratos Wistar

Optou-se pela região cérvico dorsal para a confecção das feridas por ser uma área de difícil acesso ao animal, dificultando o autoferimento.

O saca-bocado foi posicionado perpendicularmente sobre o dorso do animal e com uma leve pressão realizou-se um movimento giratório para que o tecido cutâneo se desprendesse, com a finalidade de produzir a ferida padronizada em 10 mm de diâmetro.

Utilizou-se tesoura de ponta fina para finalizar a retirada do tecido que formava o tampão e

facilitar a obtenção da ferida.

3.2.2 Grupos experimentais

Após a realização do procedimento cirúrgico experimental, os animais foram divididos em três grupos compostos por 18 indivíduos cada um. Os grupos foram designados como GC – grupo controle que não recebeu tratamento com laser; G4J – tratado com laser na dosimetria de 4J/cm² e G8J – tratado com laser na dosimetria de 8J/cm². Os animais do GC foram identificados e acomodados em gaiolas individuais também identificadas. Os animais pertencentes ao G4J e ao G8J também receberam identificação, sendo submetidos à primeira aplicação da laserterapia e, em seguida, colocados em gaiolas individuais igualmente identificadas.

3.2.3 Avaliação macroscópica das feridas

Diariamente, todos os animais foram anestesiados por via inalatória com halotano. Após o estabelecimento do plano anestésico, as feridas foram lavadas com solução salina 0,09% e gazes estéreis, para a remoção da crosta. Na seqüência as feridas foram medidas com paquímetro, para mensuração do seu diâmetro e realizado o registro fotográfico.

Ato contínuo procedia-se à observação das características macroscópicas das feridas, atentando-se para o aspecto da borda, presença ou ausência de sinais flogísticos, diminuição da ferida e aspecto da cicatriz. Em seguida a essa avaliação, os animais do GC foram recolocados em suas gaiolas e os animais do G4J e do G8J submetidos à terapia com laser.

Figura 2 – Imagem fotográfica da mensuração macroscópica da ferida cirúrgica experimental, com paquímetro

3.2.4 Tratamento das feridas com laser

As lesões foram irradiadas em um único ponto (método de aplicação pontual), no centro da ferida, a uma distância de 5 cm. Para tanto se utilizou o aparelho de laser, modelo Endophoton da KLD, com microprocessador digital, caneta em aço inoxidável com ponteira em 30º, sensor toposcópio, potência de saída de 20mW (laser vermelho visível) AlGa, comprimento de onda de 660nm, feixe colimado, área de emissão de 0,035cm², display de cristal líquido com iluminação, desligamento automático e indicador de impedância (Figura 3). O aparelho foi calibrado pelo próprio fabricante (Anexo B).

Figura 3 – Fotografia do aparelho emissor de onda de laser de baixa potência, utilizado na pesquisa. Endophoton de fabricação da KLD Biosistemas Equipamentos Eletrônicos Ltda.

Após os procedimentos diários de limpeza e mensuração das feridas, os animais do G4J e G8J foram posicionados em decúbito ventral sobre a cama de madeira com fixador dos membros para receberem a radiação laser previamente estabelecida para o grupo ao qual pertenciam (Figura 4).

Figura 4 – Imagem fotográfica da aplicação do laser pelo método pontual, na ferida cirúrgica experimental

3.2.5 Avaliação microscópica das amostras

Para a avaliação microscópica, foram estabelecidos os períodos de três, sete e 14 dias do pós-operatório, e início da aplicação do laser nos animais dos grupos G4J e G8J.

Foram avaliadas, em cada período, amostras provenientes de seis animais dos grupos experimentais GC, G4J, G8J, num total de 18 amostras por período.

A coleta das amostras foi realizada após a eutanásia dos animais, que receberam, por via inalatória, dose letal de halotano, até que ocorresse a parada cardiorrespiratória. Constatado o óbito, procedeu-se, por técnica cirúrgica asséptica, a retirada da ferida cutânea incluindo-se a margem de pele circunjacente. O material removido foi acondicionado em recipiente identificado, contendo hora e data da coleta, grupo experimental e número do animal, para imersão e fixação em formalina tamponada a 10%. As amostras foram encaminhadas ao Laboratório de Patologia Veterinária da UNIFRAN, para serem, então, processadas, incluídas em parafina e coradas com hematoxilina-eosina (HE).

As amostras foram analisadas à microscopia óptica de luz, sendo observados semi-quantativamente o infiltrado inflamatório, o edema, a formação das fibras de colágeno e o grau de epitelização. A neovascularização foi avaliada pela contagem dos neovasos em gratícula para microscópio, em área padronizada de 0,25mm².

3.2.6 Análise estatística

Os dados obtidos na paquimetria das feridas cutâneas foram analisados pelo teste T de Student com grau de significância de 95% (P<0,05). Todas as análises foram realizadas com programa GraphPad Prism 4.0.

4 RESULTADOS