O projeto foi dividido em duas abordagens terapêuticas: (i) tratamento quimioterápico e (ii) tratamento imunoquimioterápico, que serão detalhadas a seguir.
Durante a realização dos experimentos, os animais foram mantidos no setor de experimentação do Centro de Ciência Animal da Universidade Federal de Ouro Preto (CCA/UFOP), alojados 6 a 6 em gaiolas específicas para camundongos, mini-isoladas, mantidos em temperatura entre 21 a 25°C e água e ração ad libitum.
Todos os procedimentos foram realizados de acordo com os princípios éticos preconizados pelo COBEA (Colégio Brasileiro de Experimentação Animal), aprovado pelo
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Comitê de Ética em Pesquisa da Universidade Federal de Ouro Preto (Protocolo no 2014/10)(Anexo 1).
5.4.1 Tratamento quimioterápico
Nesta etapa foram avaliadas as estratégias quimioterápicas utilizando antimoniato de meglumina em diferentes tratamentos. Foram utilizados camundongos BALB/c, fêmeas com idade entre 6 a 8 semanas, proveninetes do Centro de Ciência Animal (CCA) da Universidade Federal de Ouro Preto. Os animais foram divididos em quatro grupos experimentais (n=12) e os experimentos realizados em duplicata.
Segue abaixo a descrição dos grupos experimentais utilizados nesta etapa do estudo:
Grupo controle infectado não tratado (PBS) - composto por animais que foram infectados com L. infantum e receberam 100 µL de solução salina estéril a 0,9%;
Grupo lipossoma vazio (Lip V) - composto por animais que foram infectados com L. infantum e receberam 30 µL da mistura de lipossomas peguilados e não peguilados hidratados com solução salina estéril a 0,9%;
Grupo antimoniato de meglumina (AM) - composto por animais que foram infectados com L. infantum e receberam 30 µL de antimoniato de meglumina (20 mg de Sb/Kg);
Grupo antimoniato de meglumina lipossomal (AML) - composto por animais que foram infectados com L. infantum e receberam 120 µL da mistura de lipossomas convencionais e peguilados contendo antimoniato de meglumina (20 mg de Sb/Kg) encapsulado;
No Fluxograma 1 estão representados os diferentes grupos experimentais, os tempos de experimentação e as análises laboratoriais realizadas. Todas as administrações foram realizados pela via endovenosa, na veia da cauda, 14 dias após a infecção experimental. A eutanásia dos animais foi realizada 28 dias após a infecção experimental. Após a eutanásia foram coletados fragmentos de fígado e baço, para realização das análises laboratoriais.
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Fluxograma 1: Delineamento experimental e análises laboratoriais utilizadas na avaliação dos diferentes
protocolos terapêuticos empregando quimioterápicos: controle infectado e não tratado (PBS), lipossoma vazio (Lip V), antimoniato de meglumina (AM) e mistura de antimoniato de meglumina lipossomal convencional e peguilado (AML). T0 = tempo relativo ao dia da infecção com formas promastigotas de L. infantum em fase estacionária de crescimento; Tempo Final (TF) = 28 dias após a infecção experimental.
5.4.2 Tratamento imunoquimioterápico
Nesta etapa, foram avaliadas a eficácia dos diferentes tratamentos empregando a mistura de lipossomas convencionais e peguilados contendo antimoniato de meglumina (AML) em associação com as vacinas LBSap e LBMPL. Foram utilizados 60 camundongos BALB/c, livres de germes patogênicos específicos (Specific Pathogen Free – SPF), fêmeas, com idade entre 6 a 8 semanas, proveninetes do Biotério Central da Universidade Federal de Minas Gerais. Todos os animais foram infectados com 1x107 promastigostas de L. infantum (MCAN/BR/2008/OP46) no tempo zero (T0). Os animais foram divididos em cinco grupos experimentais (n=12) e os experimentos realizados em duplicata.
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Grupo antígeno de L. braziliensis (LB) - composto por animais que receberam três doses contendo 60 μg de antígeno de L. braziliensis, pela via subcutânea na região dorsal, com intervalo de 7 dias entre as doses.
Grupo vacina LBMPL (LBMPL) – composto por animais que receberam três doses contendo 60 μg de antígeno de L. braziliensis e 25 μg de MPL-A, pela via subcutânea na região dorsal, com intervalo de 7 dias entre as doses.
Grupo vacina LBSap (LBSap) – composto por animais que receberam três doses contendo contendo 60 μg de antígeno de L. braziliensis e 50 μg de saponina, pela via subcutânea na região dorsal, com intervalo de 7 dias entre as doses.
Grupo antimoniato de meglumina lipossomal em associação com a vacina LBMPL (LBMPL + AML) - composto por animais que receberam três doses vacinais contendo 60 μg de antígeno de L. braziliensis e 50 μg de saponina, associadas com uma dose da mistura de lipossomas convencionais e peguilados contendo antimoniato de meglumina [20 mg/Kg] (no 35º dia pós-infecção), as doses vacinais foram administradas pela via subcutânea na região dorsal, com intervalo de 7 dias entre as doses. A dose da formulação lipossomal foi administrada pela via endovenosa, pela veia da cauda.
Grupo antimoniato de meglumina lipossomal em associação com a vacina LBSap (LBSap + AML) - composto por animais que receberam três doses vacinais contendo 60 μg de antígeno de L. braziliensis e 50 μg de saponina, associadas com uma dose da mistura de lipossomas convencionais e peguilados contendo antimoniato de meglumina [20 mg/Kg] (no 35º dia pós-infecção), as doses vacinais foram administradas pela via subcutânea na região dorsal, com intervalo de 7 dias entre as doses. A dose da formulação lipossomal foi administrada pela via endovenosa, pela veia da cauda.
No Fluxograma 2 estão representados os diferentes grupos experimentais, os tempos de experimentação e as análises laboratoriais realizadas nos grupos descritos anteriormente. Todos os tratamentos foram realizados pela via subcutânea, na região dorsal do animal. A eutanásia dos animais foi realizada 49 dias após a infecção experimental com L. infantum e sete dias após a última dose dos imunoterápicos avaliados. Após a eutanásia foram coletados fragmentos de baço, para realização das análises laboratoriais.
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Fluxograma 2: Delineamento experimental e análises laboratoriais utilizadas na avaliação dos diferentes
protocolos terapêuticos empregando imunoquimioterápicos: grupo controle antígeno de L. braziliensis (LB), grupo vacina LBMPL (LBMPL), grupo vacina LBSap (LBSap), grupo antimoniato de meglumina lipossomal em associação com a vacina LBMPL (LBMPL + AML) e grupo antimoniato de meglumina lipossomal em associação com a vacina LBSap (LBSap + AML). T0 = tempo relativo ao dia da infecção experimental com formas promastigotas de L. infantum; Tempo Final (TF) = 49 dias após a infecção experimental.