Nesta seção, as propriedades mecânicas (A e Lo) dos polímeros serão abordadas
variando-se a força máxima aplicada (6pN, 10.5pN e 15pN) sobre os complexos DNA- intercalantes. Assim, os experimentos foram conduzidos da seguinte forma: como na seção 3.1.4, uma molécula de DNA com as propriedades bem definidas era escolhida e,
com ela, estiramento eram realizados (∼ 5-7 medidas). Caso os parâmetros (Lo e A) do
DNA puro estivessem dentro dos valores esperados (na literatura), as alíquotas eram trocadas. Decorrido o tempo de reação, estiramentos (∼ 5-7 medidas para cada Fmax)
eram realizados com 6pN, 10.5pN e 15pN, sequencialmente. Vários experimentos foram realizados com uma mesma alíquota, retirando a média dos valores finais.
Antes da análise da interação com as drogas, é necessário medir qual o compor- tamento de A em relação a força máxima para um DNA puro. Para isso, realizou-se o mesmo procedimento acima, porém sem a presença de um ligante. Os resultados deste experimento aparecem na figura 4.2, que mostram que a persistência do DNA puro não se altera (dentro das barras de erro) com o aumento da força máxima. Até mesmo para 15pN, a afirmação anterior é válida (note que a última medida já está no limiar do regime entrópico).
Figura 4.2: Variação do comprimento de persistência A com a força máxima (Fmax) aplicada
para a molécula de DNA pura. As barras de erro fornecem o erro padrão das medidas.
Dando continuidade ao trabalho, com os resultados obtidos para o complexo formado com a doxorrubicina nas concentrações 2.5, 3.5, 4.5 e 5.5µM construiu-se o gráfico 4.3(a). As linhas tracejadas foram introduzidas apenas como guia para os olhos. Note que quanto maior Fmax menor o comprimento de persistência, ou seja,
mais flexível o polímero.
(a) (b)
Figura 4.3: Variação de A com relação a força máxima aplicada para a) doxorrubicina e b) brometo de etídio. As barras de erro fornecem o erro padrão das medidas.
O experimento análogo para o brometo de etídio foi realizado para as concen- trações do ligante de: 1.5, 2.5, 3.5 e 4.5µM, como pode ser observado na figura 4.3(b). Novamente, A decresce com o aumento da força máxima, assim como no caso da do- xorrubicina, mostrando que há uma forte dependência deste parâmetro com relação à força aplicada sobre os complexos DNA-doxorrubicina e DNA-BrEt.
Estes resultados levam a crer que este comportamento é geral para complexos DNA-intercalantes, indicando que a modificação estrutural causada pelo intercalante na dupla-hélice é a origem do efeito, ou seja, o processo de intercalação está alterando a molécula de DNA de forma que ao expor este complexo a forças máximas distintas tem-se um decréscimo de A.
O comprimento de contorno Lo para os dois casos não apresentou dependência
com a força máxima aplicada, somente com a concentração de ligante. Para a do- xorrubicina na concentração de 2.5µM, por exemplo, obtivemos Lo = (16.9 ± 0.5)µm
para 6pN, para 10.5pN, Lo = (16.9 ± 0.6)µm e para 15pN esse resultado foi de Lo =
(17.0 ± 0.4)µm, correspondendo a um aumento de 3% em relação ao DNA puro. Por outro lado, para a maior concentração de doxorrubicina, 5.5µM, Lo = (18.9 ± 0.6)µM
para 6pN, Lo = (18.6 ± 0.6)µM para 10.5pN e Lo = (19.1 ± 0.7)µM para 15pN,
correspondendo a um aumento de 14%.
A mesma análise pode ser realizada para o brometo de etídio. Assim, na concen- tração de 2.5µM, por exemplo, obtivemos Lo = (18.5±0.3)µm para 6pN, para 10.5pN,
Lo = (18.8 ± 0.5)µm e para 15pN esse resultado foi de Lo = (18.6 ± 0.4)µm, corres-
pondendo a um aumento de 13% em relação ao DNA puro. Por outro lado, para uma concentração maior, 4.5µM, Lo = (20.5 ±0.7)µM para 6pN, Lo = (20.2 ±0.6)µM para
10.5pN e Lo = (20.7 ± 0.7)µM para 15pN, correspondendo a um aumento de 24%. As
(a) (b)
Figura 4.4: Variação de A com relação a concentração total do ligante para a) doxorrubicina e b) brometo de etídio. As barras de erro correspondem ao erro padrão das medidas.
curvas de titulação usualmente são construídas com a propriedade mecânica em função da concentração total do ligante em solução. Por isso os gráficos 4.3(a) e 4.3(b) serão reconstruídos, ficando evidente como que cada Fmax altera a grandeza analisada.
Como pode ser visto em 4.4(a) e 4.4(b), para o menor valor de Fmax o comporta-
mento geral das curvas é inicialmente crescente, chegando a um valor máximo e depois caindo, o que está de acordo com vários trabalhos realizados pelo grupo do professor M. S. Rocha, onde são realizados experimentos de estiramento para Fmax < 6pN [10–15].
Além deste, outros grupos reportaram o mesmo comportamento de A, como Tessmer et al [28]. Por outro lado, o maior valor de Fmax mostra uma queda quase monotônica
de A em relação a CT. Este resultado também é reportado por uma série de grupos
como Husale et al, Lipfert et al, entre outros [22–25]. Por fim, as curvas obtidas para 10.5pN apresentam um comportamento intermediário entre as duas anteriores.
Note a gama de resultados aparentemente incoerentes advindos de técnicas de pinçamento. Isso pode ser explicado observando-se qual a força máxima utilizada, ou seja, para forças no limite do regime entrópico uma queda monotônica em A é observada mesmo para concentrações baixas do ligante, enquanto que para valores baixos da força (6pN), observa-se um comportamento não monotônico. Estes resultados ressaltam a necessidade de um estudo mais aprofundado da variação das propriedades com as forças aplicadas, além de levantar uma questão: qual deve ser a força utilizada em experimentos de estiramento ou torção para que seu efeito nos resultados seja mínimo? O efeito da queda de persistência dos complexos foi estudado e a melhor ma- neira encontrada na tentativa de explicar o fenômeno foi considerar algum tipo de desnaturação parcial, como será abordado nos parágrafos seguintes, observe a figura 4.5.
Figura 4.5: Esquema da formação das "bolhas"de desnaturação no complexo formado com intercalantes sujeito a forças externas.
Sabe-se que a intercalação gera alterações e tensiona a molécula na qual se liga. Essa ligação aumenta o comprimento de contorno Lo e desfaz o giro da dupla-hélice
por volta de 200 - 300 entre os pares de base. Todas estas modificações tensionam as
pontes de hidrogênio de bases complementares que unem as fitas simples, o que pode levar a formação de bolhas de desnaturação mesmo para Fmax baixas. A probabilidade
da formação de bolhas de desnaturação aumenta com o aumento da Fmax. A formação
de bolhas desfaz a estrutura secundária do DNA localmente, transformando a região em duas fitas simples. As fitas simples apresentam grande flexibilidade (A pequeno nm) [58], levando a uma persistência efetiva menor.
É evidente que este efeito depende da concentração do intercalante e do regime de forças utilizado nos estiramentos. Assim, caso a concentração do intercalante ou a Fmax sejam baixos o suficiente, ainda não aparecendo bolhas de desnaturação, tem-se
um A efetivo crescente com [intercalante] (concentração do intercalante). Considerando os gráficos 4.4(a) e 4.4(b), pode-se observar que para 6pN e concentrações baixas do ligante, a persistência A ainda apresenta um crescimento. Porém, quando a molécula apresenta uma quantidade razoável de sítios ocupados, a força externa é sufuciente para que as ligações entre as bases se rompam e tem-se uma desnaturação parcial, levando a um A efetivo menor, de acordo com o que foi discutido nos parágrafos anteriores.
Assim, a força máxima Fmax altera o comprimento de persistência A dos com-
plexo DNA-doxorrubicina e DNA-BrEt significantemente, ou seja, as propriedades ob- tidas por meio de experimentos de estiramento de complexos DNA-intercalantes são fortemente dependentes da força externa máxima aplicada.
Pensando de maneira conformacional, a estabilidade da estrutura secundária da molécula de DNA em solução depende da estrutura da molécula fita simples (estrutura primária), das interações hidrofóbicas, das rotações das ligações químicas, das ligações de hidrogênio e dos empilhamentos π entre os pares de base nitrogenadas (originada pelas interações entre os anéis das bases) [8]. Estudos mostram que o empilhamento π e as interações hidrofóbicas possuem papel de destaque na energia necessária para estabilizar a dupla hélice [61–63]. Logo, a maior diferença entre as configurações DNA fita simples e fita dupla são a energia livre de Gibbs devido ao empilhamento dos pares de base e as energias das pontes de hidrogênio. Matematicamante, tem-se que a enegia livre de Gibbs (G) necessária para estabilizar a dupla hélice é dada por:
∆Gest.duplah,DN Ads = ∆GDN Af s,est+ ∆Gr+t+ ∆Gemp.π + ∆GpontesH+ ∆Ghidr, (4.1)
com ∆GDN Af s,est sendo a energia livre relacionada a molécula de DNA fita simples,
∆Gr+t a energia relacionada com modificações estruturais, ∆Gemp.π a energia dos em-
pilhamentos dos pares de base, ∆GpontesH energia relacionada as pontes de hidrogênio
e ∆Ghidr é a energia devido as interações hidrofóbicas [63]. Quanto mais negativa é
∆Gest.duplah,DN Ads mais favorável é a formação da estrutura de dupla hélice. Todas
essas energias são calculadas como a variação entre dois estados: molécula de DNA fita simples − > molécula de DNA fita dupla.
Quando um intercalante se acomoda entre os pares de base, tanto a energia rela- cionada a modificações estruturais quanto as interações entre os pares de base no sítio da intercalação são comprometidas. Assim, a energia de estabilização da dupla hélice cai, aproximando a configuração da molécula de DNA fita dupla da fita simples. Isso possibilita que, dependendo de quanto ∆Gest.duplah(intercal.) (energia de estabilização da
dupla hélice após a intercalação) for próximo da ∆GDN Af s,est (energia de estabilização
das fitas simples), forças externas relativamente baixas sejam sufucientes para levar a mudança estrutural local. O que formaria uma bolha de desnaturação.
Considerando um segmento da molécula de DNA com, por exemplo, 12 pares de base (∼ 4, 8nm) tem-se que a modificação na estabilidade da molécula pode variar de ∆G = 0 à ∆G = 4(∆Grot.int+∆Gemp.π.int+∆Ghidro). Sendo que ∆G = 0 corresponderia
a nenhuma molécula de intercalante ligada e ∆G = 4(∆Grot.int+∆Gemp.π.int+∆Ghidro)
a energia decrescida devido a saturação nas intercalações (obs.: experimentos mostram que no processo de intercalação aproximadamente 3 sítios de ligação da molécula de DNA são ocupados [1,27]).
Suponha que as contribuições das energias de rotação e de empilhamento π sejam praticamente anuladas na intercalação, restariam somente as ligações de hidrogênio para serem vencidas pela força externa. Tendo isso em mente, pode-se estimar a força necessária para que as bolhas sejam geradas. Considerando que a energia envolvida nas
ligações de hidrogênio seja de 5kBT por ligação (T = 298K) [32,59] tem-se que a energia
necessária para quebrar as pontes entre pares de base quaisquer é ∼ (2, 5)GpontesH =
12, 5kBT . Isso seria equivalente a 1/8 da energia necessária em uma ligação covalente
(100kBT ou 500KJ/mol). Com relação a pinça óptica, esse valor corresponderia a uma
força externa máxima da pinça de ∼ 50pN. O que é um valor alto, mas precisamos pensar em todas as aproximações realizadas e no fato de que a torção também retira parte da estabilidade das pontes de hidrogênio.
A intercalação é um processo energeticamente favorável, principalmente devido a interações hidrofóbicas, levando a um complexo mais estável quanto a desnaturação total [60]. Um complexo DNA-intercalantes pode ser pensada como uma molécula de DNA com grampos (intercalantes) aumentando sua estabilidade global. Assim, esses "grampos"impediriam que a desnaturação total ocorresse, mas por outro lado, a presença destes gera tensões entre as ligações de hidrogênio já existentes. Logo, teríamos um complexo mais estável globalmente, mas que poderia também se modificar localmente.
Em experimentos onde somente as forças internas ao sistema estão presentes, a queda em A presente nos gráficos 4.4(a) e 4.4(b) não é observada. Usualmente, neste tipo de experimento, o comprimento de persistência cresce com a concentração do in- tercalante e estabiliza em um valor acima do esperado para o DNA puro [16–21], ou seja, são curvas monotônicas crescentes (figura 4.6), bem diferentes do observado em experimentos de pinçamento. Além disso, trabalhos de intercalantes com compostos condensadores (PEG e BSA) mostraram que os agentes intercalantes inibem a compac- tação dos complexos finais [64–67], indicando um aumento na rigidez dos mesmos. Os agentes condensadores trabalham "protegendo"as pontes de hidrogênio, enquanto que o intercalante se acomoda entre os pares de base aumentando a tensão local. Logo, neste tipo de experimento, não ocorre desnaturação parcial, somente um aumento efetivo em A. Estes resultados consolidam a interpretação da dependência de A com Fmax.
Realizamos também medidas de deposição de AFM, figura 4.6, as quais corro- boram muitos dos trabalhos de deposição de intercalantes, levando a comportamentos monotônicos crescentes de A em relação a Cint (concentração do intercalante).
Figura 4.6: Dados de persistência de complexos formados com doxorrubicina obtidos via deposição AFM. As barras de erro correspondem ao erro padrão das medidas.
Além dos experimentos acima citados, outra tentativa de evidenciar o papel da Fmax foi realizar o processo inverso de estiramento para duas concentrações de
brometo de etídio (2.5 e 3.5µM) e uma concentração de doxorrubicina (4.5µM), ou seja, primeiramente estirou-se o complexo com 15pN, depois com 10.5pN e, por fim, com 6pN, isso tudo depois que a alíquota foi trocada. De fato, pode-se observar que, para concentrações < 4, 5µM para a doxorrubicina (figura 4.4(a)) e < 2.5µM para o BrEt (figura 4.4(b)), a atuação da menor força (6pN) não é o suficiente para que a desnaturação ocorra. No entanto, quando utiliza-se 15pN, mesmo nestas concentrações, o valor efetivo de A cai indicando a formação das bolhas de desnaturação. Logo, caso a atuação da força externa não modifique a estrutura do complexo, o valor de A não dependerá da ordem na qual as forças sejam aplicadas.
Os resultados estão presentes no gráfico 4.7, os quais mostram que após serem estirados com 15pN os complexos apresentam valores de A iguais para todas as Fmax
(dentro das barras de erro). Pode-se concluir, portanto, que a estrutura realmente se alterou, sendo que o complexo agora apresenta regiões de fitas simples, as quais provavelmente se originaram com 15pN. Caso isso não ocorresse os valores de A para 6pN seriam por volta de 60nm para a doxorrubicina enquanto que para o BrEt teríamos
Figura 4.7: Variação do comprimento de persistência A com a força máxima (Fmax) para
duas concentrações de bromento de etídio (2.5 e 3.5µM) e uma concentração de doxorrubicina (4.5µM) onde o processo inverso de estiramento foi realizado. Sendo os complexos primei- ramente estirados com 15pN, depois com 10.5pN e, por fim, com 6pN. As barras de erro correspondem ao erro padrão das medidas.
valores de 70nm para a concentração de ∼ 2.5µM. Observando os dados podemos concluir que esse efeito é irreversível.
A abordagem utilizada na interpretação dos resultados se baseia no fenômeno de desnaturação parcial, o qual indica uma desestruturação local. Como se sabe, modificações estruturais devem analisadas dentro do regime entálpico. Sendo assim, o que justificaria a utilização da equação de Marko e Siggia (restrita para o regime entrópico)?
Cada um dos valores de persistência mensionados nos gráficos foram o resultado da média de vários estiramentos para uma mesma concentração de intercalante e uma mesma força externa. Estes estiramentos realizados com uma concentração alta de intercalante mostraram uma queda abrupta da persistência logo na primeira medida (mesmo para forças baixas), enquanto que o valor se tornou invariante nas demais (dentro da barra de erro). Isto significa que o complexo desnaturou parcialmente muito rápido, provavelmente durante o primeiro estiramento. Assim, qualquer efeito entálpico estaria restrito à primeira medida, e a partir da segunda temos um polímero
semiflexível onde o WLC é válido. Em outras palavras, o efeito entálpico existe, mas ocorre e acaba muito rapidamente, provavelmente todo no primeiro estiramento.
Atualmente não há nenhum modelo que trabalhe em baixas forças e ainda seja capaz de trabalhar com esse tipo de efeito, mensionado no perágrafo acima. Portanto, o modelo WLC ainda é a melhor alternativa na análise dos dados experimentais.
Um outro ponto importante, está relacionado com os resultados apresentados pelo gráfico 4.7. Esses dados nos mostram que a modificação estrutural é irreversível e, se a queda na persistência fosse somente um efeito do modelo utilizado, ela não faria sentido. Assim, os resultados não seriam dentro das barras de erro os mesmos e sim, uma reprodução dos dados utilizando as forças de maneira crescente.
Por fim, um último experimento foi realizado para corroborar a suposição de desnaturação parcial do complexo. A idéia deste experimento é mostrar caso haja alguma modificação estrutural, o que pode ser observado com curvas de histerese. Para isso, inicialmente estiramos o complexo formado com a doxorrubicina (4.5µM) até quase em sua extensão máxima (∼ 0.97Lo) e em seguida revertemos a velocidade do
piezoelétrico para voltar a posição de equilíbrio com 6pN, como mostra os diamantes pretos e os quadrados verdes na figura 4.8. Estas curvas não apresentam diferenças, ou seja, nenhuma modificação estrutural aconteceu no complexo para 6pN. Ainda pode-se ajustar as curvas, ida e volta para 6pN, com o modelo WLC [50] obtendo-se os valores A de acordo com 4.4(a).
Na outra parte deste experimento, o complexo foi estirado com 6pN até ∼ 0.97Lo
(considerando uma molécula com 16.5µm, o estiramento seria até ∼ 16µm) e, nesse momento, a potência do laser foi alterada (15pN) levando novamente o complexo para a posição de equilíbrio. Os círculos em vermelho na figura 4.8 mostram a volta do complexo com 15pN, onde evidencia-se a modificação estrutural do complexo já que uma aparente desestruturação ocorreu. Compatível com a ideia da formação das bolhas de desnaturação.
Este mesmo tipo de experimento também foi realizado para moléculas de DNA puro, não sendo vista nenhuma modificação nas curvas de força x extensão, mesmo para os maiores valores de Fmax. Esse resultado indica que o efeito esta relacionado a
Figura 4.8: Curvas de força por extensão de um complexo formado com doxorrubicina (4.5µM). Onde os quadrados verdes e os diamantes pretos mostram o estiramento e volta a posição de equilíbrio para 6pN, enquanto que os círculos em vermelho mostram a volta para um DNA que teve a força da pinça alterada de 6pN para 15pN próximo ao seu valor máximo de extensão.
persistência do DNA-intercalante.
É importante ressaltar que este experimento foi realizado com somente um esti- ramento, pois a modificação estrutural se encontra restrita a primeira medida. Assim, vários experimentos foram realizados com o intuito de estirar somente uma vez um com- plexo DNA-intercalante de acordo com o procedimento mostrado acima, fornecendo os resultados da figura 4.8. Depois que a modificação ocorre, tem-se um novo polímero semiflexível com novas propriedades mecânicas (Lo e A).
Mesmo considerando a interpretação de que hà alteração entalpica, ainda as- sim existiria uma defasagem entre os resultados obtidos por meio da pinça óptica e pelas deposições em AFM, o que corrobora nossa interpretação da dependência das propriedades mecânicas com a força externa aplicada.
Depois de realizar todos os experimentos com DNA-intercalantes, pode-se afir- mar, sem sombra de dúvida, que não somente o regime entalpico de forças pode alterar
as propriedades mecânicas. Isso por que, mesmo dentro do regime entrópico também há o efeito causado por forças máximas distintas, para o caso de complexos formados com intercalantes [68]. Assim, os menores valores de Fmax possíveis devem ser utilizados de
Experimentos com Bottle Brush
Os polímeros do tipo "bottle brush"apresentam uma cadeia de monômeros prin- cipal, da qual emergem cadeias laterais secundárias menores iguais. Logo, essa es- trutura é classificada como um polímero ramificado [1,2,33]. A figura 5.1 mostra a estrutura desse tipo de polímero e à esquerda, tem-se um zoom do mesmo.
Nas articulações do corpo humano podemos encontrar exemplos de estrutura tipo bottle brush. A lubricina (Lubricin), agrecana (aggrecan) e ialoronana (Hyaloro- nan) são responsáveis tanto pela lubrificação, capacidade de suportar o peso e evitar o desgaste das cartilagens. Trabalhos recentes associam a falta de lubricina no líquido senovial com a osteoartrite [69]. Um outro exemplo de polímero ramificado aparece nos neurofilamentos. As cadeias laterais são carregadas e se a interação dos braços se der de maneira incorreta, pode-se levar a doenças neuro-motoras [70].
Devido à importância destes polímeros, muitos trabalhos visam sintetizar com- postos similares a lubricina [71,72]. O objetivo desses estudos é melhorar tanto a durabilidade de próteses quanto o tratamento de doenças como a osteoartrite. Além disso, existem trabalhos que utilizam estruturas "bottle brush"formadas com moléculas de DNA, visando a eficiência na detecção de biomoléculas por fluorescência [72,73].
Neste trabalho deseja-se construir um polímero tipo "bottle brush"e estudar suas propriedades, visando, posteriormente, a síntese de complexos que sejam estruturas individuais (monomoleculares), possivelmente protetoras, com a rigidez e o contorno controlados. Já que a proteína Sso7d-C8 foi sintetizada artificialmente, não existem
Figura 5.1: Esquema da estrutura de um polímero tipo "bottle brush", ou seja, ramificado.
muitos trabalhos na literatura abordando suas características [74], o que nos motiva a pesquisar possíveis aplicações.
Neste capítulo os resultados dos experimentos realizados com DNA-Sso7d-C8 utilizando PO e AFM serão apresentados e discutidos com base nos nossos objetivos.
5.1 DNA 3kbp e Sso7d-C8
A proteína recombinante Sso7d-C8, utilizada neste experimento, foi sintetizada pelo grupo do professor Renko de Vries [29], pesquisador da universidade de Wage- ningen. Este é um novo composto artificial altamente assimétrico, produzido com o