Outro fator que demonstra a estreita relação desenvolvida entre carrapatos e seus hospedeiros foi o desenvolvimento ou a seleção de mecanismos que levaram a especificidade ao hospedeiro. Carrapatos coevoluiram com seus hospedeiros e parecem ter desenvolvido estratégias comuns com mecanismos específicos entre as diferentes combinações de espécies de carrapatos e hospedeiros. Evidentemente, essa relação se estabeleceu de acordo com os mecanismos já abordados mas ocorreu de forma ligeiramente diferente entre as espécies e para bovinos, diferentemente entre raças. Não é demais ressaltar o papel da imunidade do hospedeiro no estabelecimento dessa relação, e as diferenças que podemos observar entre as raças taurinas e zebuínas em resposta às infestações e aos antígenos de carrapatos (Abatepaulo et al., 2008; Carvalho et al., 2008; Turni et al., 2002; Wambura et al., 1998; Franzin et al., em preparação; Moré et al., em preparação). Está bem estabelecido que, no caso de bovinos, o gado zebuíno (Bos indicus) é menos acometido por carrapatos que o gado europeu (Bos taurus) (Frisch, 1999; Wambura et al., 1998). Contudo, os mecanismos que conduzem a resistência aos ectoparasitas ainda não foram efetivamente elucidados, mas os dados acumulados na literatura atual sugerem o envolvimento de linfócitos Th1 e reação cutânea tardia com participação de basófilos, conhecida como “do tipo Jones-Mote” (Allen, 1973;
Bechara et al., 2000; Brown e Askenase, 1985; Brown et al., 1982; Ferreira et al., 2003; Latif et al., 1991a; Latif et al., 1991b). Além disso, pelo menos em cobaias, foi demonstrada que essa resistência poderia ser transmitida parcialmente pelo soro de animais infestados,
38 indicando a importância dos anticorpos na proteção (Trager, 1939). Possivelmente esses dados contribuirão para a identificação e seleção de antígenos protetores.
Nas últimas décadas muito esforço tem sido empregado no intuito de se desenvolver uma vacina anticarrapato eficaz. Atualmente estão disponíveis no mercado de produtos veterinários duas vacinas: Gavac™ (Rodriguez et al., 1995a; Rodriguez et al., 1995b) de fabricação cubana (Heber Biotec), e TickGard Plus™ (Willadsen et al., 1995) de fabricação australiana (Intervet). Ambas foram desenvolvidas contra o antígeno Bm86, que é uma glicoproteína de superfície de 86 kDa de células intestinais de carrapatos. Infelizmente, a eficiência dessas vacinas não tem sido satisfatória, e mesmo com seu uso, ainda se faz necessário utilizar formas químicas de controle, além dos sucessivos reforços que devem ser administrados, dificultando o manejo da vacina. O antígeno Bm86 é um antígeno oculto (concealed antigen), ou seja, não ocorre sua exposição ao hospedeiro durante uma infestação natural. Isso pode comprometer a eficiência da vacina, uma vez que sem exposição frequente ao antígeno não ocorre preservação de imunidade. Esse certamente é um aspecto negativo desse tipo de vacina, que poderia ser contornado com estratégias que utilizem antígenos expostos, como os antígenos salivares.
Outro fator que deve ser considerado é a complexidade do carrapato, que muito provavelmente exigirá uma vacina multicomponente. Atualmente, existem outros antígenos candidatos potenciais sob avaliação para controlar diferentes espécies de carrapatos, porém, dentre os já testados, nenhum apresenta eficácia compatível com as exigências da produção animal. Além disso, é desejável que vacinas anticarrapatos modernas controlem mais de uma espécie de carrapato, bem como interfiram na transmissão de patógenos (de la Fuente e Kocan, 2003). No Brasil, o Ministério da Agricultura, Pecuária e Abastecimento (MAPA), juntamente com órgãos associados como a Empresa Brasileira de Pesquisa Agropecuária (EMBRAPA), divulga boletins e comunicados técnicos atualizados com o objetivo de auxiliar produtores rurais brasileiros no controle dos carrapatos (Catto et al., 2010; Koller et al., 2009).
Entretanto essas publicações enfocam especialmente o aprimoramento de estratégias convencionais de controle e não sugerem novas estratégias eficientes e sustentáveis para solução do problema, como pretende o presente trabalho. Assim, a atual situação exige que novos antígenos sejam descobertos. As abordagens genômicas/proteômicas e leituras imunobiológicas de alta processividade permitem que essa demanda seja atendida de forma otimizada.
39 1.3.2 Uso de estratégias genômicas e proteômicas na descoberta de antígenos
O advento das tecnologias em genômica e perfilamento de genes em larga escala, de fato, têm tornado possível estabelecer um conjunto mais abrangente daqueles expressos em situações fisiológicas distintas de parasitas, e vêm mostrando diferenças na expressão gênica em órgãos e tecidos durante as múltiplas fases do desenvolvimento parasitário. Essa abordagem tem se mostrado bastante interessante para os artrópodes, visto que ao se comparar glândulas salivares de ninfas e adultos de carrapatos I. scapularis observou-se que vários genes são expressos diferencialmente, dependendo da forma parasitária (Nazareth et al., 2006;
Ribeiro et al., 2006). Esse tipo de informação pode orientar a escolha de antígenos no sentido de identificar aqueles cuja expressão estende-se a todas as fases parasitárias, ou ainda outros que desempenham papel crucial em determinada fase. Vale lembrar que a resposta imune do hospedeiro afeta profundamente a expressão gênica dos parasitas, inclusive carrapatos, fenômeno atestado pelos inúmeros mecanismos de escape já descritos. Tecnologias recentes, como a construção de transcriptomas, tem se mostrado promissoras para a triagem rápida, sistemática e global de antígenos e podem representar um interessante método para a seleção de candidatos vacinais (de la Fuente e Kocan, 2003).
As tecnologias disponíveis para estudos de transcriptomas possibilitaram a clonagem em larga escala dos genes de interesse (GIs) e a realização de testes de imunogenicidade, como por exemplo, com antígenos entregues sob a forma de DNA nu para avaliação da resposta cutânea induzida (Ciprandi et al., 2006). Os ensaios realizados por Valenzuela e colaboradores mostraram que 25-30% dos GIs testados induziram reações de hipersensibilidade cutânea tardia (DTH), tanto para flebotomíneos quanto para carrapatos I.
scapularis e, entre os GIs dos primeiros, apenas 50% dos positivos para DTH mostraram capacidade para induzir resposta humoral, o que sugere que nem todo GI induz necessariamente os dois tipos de resposta (Oliveira et al., 2006; Valenzuela, comunicação pessoal). Esses resultados reforçam a necessidade de triar os GIs quanto à sua capacidade de induzir respostas celulares. Mais recentemente o grupo do Valenzuela mostrou que nem sempre GIs indutores de resposta cutânea tardia são protetores, contudo se induzirem a produção de citocinas relacionadas ao perfil Th1, como IFN-γ, o são (Oliveira et al., 2008b).
Além disso, o caráter multicomponente da DTH tem auxiliado a determinação do status da resposta imune a diferentes antígenos (Dietert et al., 2010; Hernandez et al., 2005), entretanto seu papel na proteção contra patógenos ainda é controverso (Belkaid et al., 2000; Gomes et
40 al., 2002; Valenzuela et al., 2001). Na medicina veterinária, associada à detecção de resposta imune humoral, a avaliação da DTH tem se mostrado útil para detecção de resistência a doenças (Heriazon et al., 2009; Hernandez et al., 2003).
Por outro lado, interferência por RNA (RNAi) é uma abordagem de genética reversa baseada no uso de ácidos nucléicos para o controle da expressão gênica, em nível pós transcricional. O processo se inicia com a síntese de uma molécula de RNA de dupla-fita (dsRNA) específica para o gene de interesse que em seguida, é clivada por uma enzima chamada Dicer, presente no citoplasma. Essa clivagem origina diversas moléculas de RNA
“curtas” (short interference RNAs, siRNA). Esses siRNAs associados ao complexo enzimático RISC (RNA-induced silencing complex), se ligam ao mRNA do gene de interesse, levando à degradação do mRNA de forma a guiar a regulação gênica (Mello e Conte, 2004).
Mecanismos de silenciamento pós-transcricionais de genes por moléculas de RNA foram descritos para todos eucariotos estudados até o momento, e a interferência por RNA se mostrou uma excelente ferramenta para estudar a genômica funcional de uma variedade de organismos, além de outras aplicações (Araujo et al., 2007; Mitchell et al., 2007; Zhou et al., 2006a). Trabalhos recentes têm sugerido que a tecnologia de interferência por RNA pode auxiliar na descoberta de antígenos contra diversos patógenos/parasitas (Hannon, 2002), dentre eles os carrapatos (de la Fuente et al., 2006a), através da análise da ausência da função da proteína estudada. Com isso, é possível prever o papel que a imunidade protetora teria sobre o desenvolvimento do carrapato caso fosse anulada a atividade dessas proteínas (antígenos). Trata-se, portanto, de mais uma técnica baseada numa estratégia genômica, nesse caso, acompanhada de uma triagem in vivo, uma vez que os GIs são silenciados diretamente nos carrapatos. Diversos trabalhos têm mostrado o papel dessa estratégia na descoberta de antígenos para controle e terapêutica do câncer e de uma ampla gama de agentes, entre eles vírus, bactérias e parasitos (Hirsch, 2010; Katakowski e Palliser, 2010; Yoshino et al., 2010).
Alguns trabalhos demonstram a utilização de interferência por RNA na triagem de antígenos de carrapatos (de la Fuente et al., 2005; de la Fuente et al., 2006b; Narasimhan et al., 2004;
Nijhof et al., 2007; Ramakrishnan et al., 2005). Seu uso otimiza o rastreamento de um número grande de genes de uma só vez em busca de potenciais candidatos a uma vacina, uma vez que despende um período curto de tempo e exige um número pequeno de animais. Esses estudos têm auxiliado a confirmar a função predita de genes, avaliar seu papel na biologia dos ácaros e propor a seleção de antígenos candidatos para o desenvolvimento de vacinas.
41 Associada às outras técnicas para avaliação de moléculas candidatas, a produção das proteínas recombinantes correspondentes aos GIs estudados tem sido largamente empregada.
Com isso, tem sido possível realizar a caracterização, avaliação da imunogenicidade e potencial vacinal dessas moléculas para uma ampla gama de enfermidades (Barnard, 2010) e estudos recentes demonstraram o uso de estratégias proteômicas na identificação de antígenos candidatos de vetores artrópodes (Souza et al., 2010; Teixeira et al., 2010).
À luz do conhecimento atual da biologia dos carrapatos em posse das modernas estratégias “ômicas”, a pesquisa por antígenos protetores tem se focado em moléculas não ocultas (Ribeiro e Francischetti, 2003), ou seja, proteínas que estejam em contato com o hospedeiro durante a infestação, já que são consideradas como as responsáveis pelo sucesso da hemostasia, embora a associação de moléculas com essas funções ainda pode ser empregada (Habeck, 2002; Trimnell et al., 2002). Além disso, tem sido possível identificar moléculas imunogênicas através do estudo das glândulas salivares ou de moléculas presentes na saliva dos ácaros que podem ser utilizadas como antígenos vacinais, protegendo os hospedeiros das infestações e possivelmente da transmissão de patógenos. O contato dos hospedeiros com essas moléculas em condições naturais contribuiria para a manutenção da memória imunológica. Em vista do exposto, a intrigante questão se o bloqueio da imunossupressão induzida pelos carrapatos contribuiria para a aquisição de resistência a esses ácaros permanece em discussão e recentes avanços vem sendo adquiridos na identificação de moléculas essenciais ao estabelecimento da relação parasita-hospedeiro. A participação das estratégias genômicas e proteômicas na busca e identificação dessas moléculas candidatas vacinais, especialmente para carrapatos (Anatriello et al., 2010; de la Fuente et al., 2010;
Maruyama et al., 2010), merece destaque.
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Objetivos
43 2 Objetivos