Descrição da embriogênese de L culveri

No biotério, em uma bandeja de plástico, os poliquetas foram separados em indivíduos imaturos e férteis vizualmente, sem auxílio de equipamento óptico. A identificação dos poliquetas férteis dos imaturos foi feita a partir do padrão de cor da superfície do corpo descrito por Mazurkiewicz (1975), respectivamente esverdeados e avermelhados. Na primeira coleta de indivíduos parte dos indivídios férteis foi observada em microscópio estereoscópico, com o objetivo de confirmar a descrição feita por Mazurkiewicz (1975). Foi possível observar nas fêmeas férteis ovos esverdeados por transparência na cavidade celomática, os machos são mais claros devido a abundância de esperma (Figura 54.A-D). Foi observado nos machos e nas fêmeas os gametas (Figura 54.E-F). A separação ocorreu somente entre férteis e imaturos, não houve separação entre machos e fêmeas.

Os aquários com indivíduos férteis foram monitorados para a observação do momento aproximado da fecundação, demarcado após o surgimento de ovos ou embriões no sedimento. Amostras de sedimento em placa de petri foram observadas em microscópio estereoscópio Olympus SZX16 e LABOMED Luxeo 4D, respectivamente no Laboratório de Invertebrados (Labin) e Laboratório Integrado de Bioquímica Hatisaburo Masuda do Nupem da UFRJ-Macaé. No primeiro dia o monitoramento foi feito a cada duas horas e nos dias seguintes, diariamente. A partir da liberação dos gametas e da observação do surgimento dos primeiros ovos fecundados ocorria a separação destes sob os mesmos microscópios estereoscópios e a montagem dos aquários somente com os embriões. Os aquários com embriões passavam então a serem também monitorados, e a cada novo estágio observado um novo aquário era montado, facilitando o controle de duração de tempo de cada um dos estágios. Os aquários com indivíduos imaturos tinham seus indivíduos semanalmente conferidos, e sempre que ocorria a observação de um indivíduo fértil este era separado dos demais e realocado nos aquários com indivíduos férteis.

Figura 54. L. culveri. (A) Adulto imaturo de cor avermelhada, vista dorsal; (B) Adulto fértil de cor esverdeada – Macho, vista dorsal; (C) Adulto fêmea fértil esverdeada, vista dorsal; (D) Ovos verdes na cavidade celomática de uma fêmea indicados pelas setas; (E) Gametas femininos de cor verde, após dissecção de uma fêmea indicados pelas setas; (F) Água da placa de Petri com aspecto leitoso após liberação espontânea de gametas masculinos, indicados pelas setas, por um indivíduo fértil.

Após a fecundação espontânea nos aquários com os indivíduos férteis os estágios de desenvolvimento de L. culveri foram anestesiados com mentol em placas de petri e fotodocumentados in vivo em microscópios estereoscópios do tipo Olympus SZX7 e

LABOMED Luxeo 4D, respectivmente no Labin e no LIBHM da UFRJ-Macaé. Após observação, os embriões que estavam nos aquários foram fixados em paraformoldeído (4%) com água da lagoa a fim de evitar o choque osmótico e danificar a fixação dos indivíduos. Em seguida os embriões fixados foram observados e fotodocumentados em microscópio óptico (Nikon 80i) na Unidade Integrada de Imagens do NUPEM/UFRJ e descrição dos estágios de desenvolvimento.

Para a visualização no microscópio de fluorescência Nikon 80i, Unidade Integrada de Imagens do NUPEM/UFRJ os embriões fixados foram transferidos para um eppendorf contendo uma solução tampão fosfato-salina (1:1) produzida com água destilada e com adição de 0.1% de Tween-20 (PBST). Os embriões foram lavados três vezes em uma solução tampão (PBST) para a retirada de qualquer resíduo do paraformoldeído. Em seguida foi acrescentado ao eppendorf com os embriões o corante DAPI (4’6’-diamidino-2-fenilindol – produzido pela Invitrogen®) na concentração de 1µg/L. Este corante quando associado a dupla-fita do DNA tem sua máxima absorção no comprimento de onda de 358nm (ultravioleta) e seu máximo de emissão é de 461nm (azul), tornando os núcleos celulares fluorescentes.

2.5. RESULTADOS & DISCUSSÃO

2.5.1. Cultivo

Para montagem dos aquários de cultivo, o sedimento amostrado foi peneirado em peneira granulométrica, sendo descartados os grãos menores que 500µm. Essa seleção granulométrica foi feita de acordo com Mazurkiewicz (1975), que após testes com o cultivo da espécie registrou para esse tamanho de grão a menor taxa de mortalidade dos espéciemes de L. culveri em seus experimentos. Além disto, através desta seleção que excluía as menores partículas, foi evitado a ressuspensão do sedimento na coluna d’água, que dificultaria a visualização durante a manipulação dos aquários. Em seguida, o sedimento selecionado foi autoclavado por uma hora e resfriado naturalmente no mínimo três dias antes das coletas na lagoa Visgueiro. A água da lagoa para a montagem do cultivo foi filtrada em peneira com malha de 50µm para a retirada do excesso do fitoplâncton e mantida em um recipiente de

plástico opaco de 20l com oxigenação em 8,5mg/L controlada através de oximetro YSI modelo 85.

Foram montados três tipos de aquários de cultivo para L. culveri que receberam: (1) indivíduos imaturos; (2) férteis e (3) embriões. Cada aquário teve seu fundo coberto com cerda de 1,5cm de sedimento e enchido com água até a metade da sua capacidade, a quantidade de sedimento e de água foi calculada para garantir a sobrevivência e facilitar o manuseio de L. culveri (Figura 55.A-C). Cada aquário recebeu uma etiqueta contendo o número de indivíduos inicialmente do aquário, a data da coleta dos indivíduos e da montagem do aquário. A montagem dos aquários com indivíduos férteis separados dos imaturos foi realizada para que houvesse maior probabilidade de sucesso da fecundação espontânea.

Figura 55. Aquários de cultivo de L. culveri no Biotério do NUPEM. (A) Aquários; (B)

A quantidade de aquários para o cultivo variou de acordo com a abundância de L. culveri coletados e também da sobrevivência destes no Biotério, porém nunca foram montados mais de 10 aquários devido a limitação do espaço físico disponível no biotério para montagem dos aquários. Para os indivíduos imaturos foram utilizados aquários de vidro retangulares com capacidade para 2 ou 4l, sendo que nos aquários de 2l foram acondicionados até 25 indivíduos adultos, e nos de 4l até 35 indivíduos adultos. Para os indivíduos férteis e embriões foram utilizados aquários redondos com capacidade para 500ml ou 1l, sendo que nos de 1l foram acondicionados até 15 indivíduos férteis ou até 40 larvas a partir da observação em microscópio estereoscópio do estágio de formação do 10o setígero e nos de 500ml até 30 embriões até o estágio de formação do nono setígero.

Os indivíduos de L. culveri foram alimentados duas vezes por semana com uma mistura em proporções semelhantes de Tetramin® e Alcon® com 0.1g por indivíduo, como descrito para por Reish (1980) para a espécie Neanthes arenaceodentata. Para verificar o nível de excretas na água dos aquários foram realizados testes semanais da Labcontest®, utilizados comumente para aquários de água salgada. Sempre que o nível de amônia e de nitrito atingiam níveis prejudiciais para o cultivo indicado pelos testes, água dos aquários era parcialmente trocada.

As condições de pH, oxigênio e de salinidade da água dos aquários foram mantidas as mais próximas as da lagoa Visgueiro, respectivamente em 7,5 – 8, 8,5mg/L e 30%. A determinação destes valores se deu pela variação média dos valores para a lagoa Visgueiro durante as coletas realizadas por Leitão (im. prep.). Para a checagem da regulação destes fatores foram utilizados o pHmetro Quimis modelo Q400AS, o oxímetro YSI modelo 85 e o salinômetro tipo refratômetro LABORCHEMIKER modelo LCK-211. Inicialmente estes parâmetros foram medidos cinco dias por semana, e a partir da estabilização destes nas quantidades desejadas, passou a ser realizada semanalmente. Foi colocada uma lâmpada de luz branca de 20W para controle de fotoperíodo com simulação de 12h/dia e 12h/noite.