Desenho de oligonucleotídeos 5.1 H pylori:

Foram desenhados três pares de oligonucleotídeos para amplificar três genes específicos de H pylori: O oligonucleotídeo RNA ribosomal 16S que amplifica uma seqüência do gene específico para o gênero Helicobacter num tamanho de 399-pb (Taylor et al, 1992), o oligonucleotídeo ureC que amplifica um fragmento interno do gene ureC/glmM num tamanho de 294pb.(Germani, 1997) e vac que amplifica um gene nos tamanhos de 259 e 286 pb específicos para Helicobacter pylori . Esses

oligonucleotídeos foram utilizados posteriormente nos PCRs realizadas com amostras de pacientes com suspeita de estarem infectados com a bactéria.

Tabela de oligonucleotideos

Nome Sense/antisense Tamanho(pb)

Vac ATGGAAATACAACAAACACAC// CTGCTTGAATGCGCCAAAC

amplifica um gene de 259e 286

Urec GGATAAGCTTTTAGGGGT AGGG/ GCTTACTTTCTAACACTAACGCGC amplifica um gene de 294 pb. RNA r 16 S AACGATGAAGCTTCTAGCTTGCTAG GTGCTTATTCCTAAGATACCGTCAT

amplifica um gene com tamanho de 399pb.

GFP CCCGGATCCATGGTGAGCAAGGGCG

6.) PCR em infecção artificial de amostras de DNA de fezes.

6.1)1 µl do DNA obtido de fezes a partir dos métodos de Holland e Lise alcalina foram previamente misturado com o plasmídeo pECFP-C1 que contém o gene GFP. e adicionados a um volume de 50 µl contendo 5µl de tampão buffer, 2 µl de dntps 2.5 mmoles/ml, 3 µl de MgCl2 (1,5mM), 0,5 µl de enzima Taq Polimerase (5 UI/µl) , 1 µl de oligo sense GFP (100 pmoles/ul) e 1 µl de oligo antisense GFP (100 pmoles/µl) e 36 µl de água milliQ. Na mistura final foram adicionados 40 µl de óleo mineral para prevenir evaporação. O ciclo foi 1 vez 94 °C por 4 min; seguidos de 30 ciclos de 94 °C, por 1 min; 48°C por 1 min; 72 °C por 1 min; e 72°C, por 7 minutos.

Desenhamos oligonucletídeos que amplificam o produto de GFP com tamanho de 700 pb. Este plasmídeo foi misturado ao DNA das fezes previamente obtido a partir de dois métodos escolhidos (Holland e Lise alcalina/Triton x-100 precipitado com Etanol). Uma diluição seriada do plasmídeo foi realizada desde 100 ng, ate 1ng. Posteriormente o plasmídeo nas diferentes quantidades foi misturado ao DNA.

Previamente foram determinadas as condições ideais de amplificação do produto GFP por PCR. Testamos temperaturas de melting entre 43°C e 53°C e diferentes concentrações de MgCl2 (0.5 e 4.0 mM). A temperatura de melting e concentração de MgCl2 finais foi 48 C e 1,5mM respectivamente. Como controle positivo do

contém o gene GFP. Uma vez realizada a PCR, as amostras foram aplicadas em gel de agarose TBE 0,8%.

Foi utilizado o plasmídeo pEFPc1 (Invitrogen, USA) o qual contém a região carboxi terminal do gene GFP, utilizado como alvo de DNA controle das infecções artificiais realizadas com fezes.

Mapa de Restrição e múltiplos sítios de clonage do plasmídeo pECFP-C1, utilizado na infecção artificial em fezes.

6.2)Uso de Sílica nas amostras de DNA. O DNA obtido das fezes, através do método de Lise Alcalina, foi tratado com sílica e misturado ao plasmideo exógeno (pECFP-C1), com o opbjetivo de eliminar completamente possíveis inibidores de PCR.

À amostra de DNA obtida por Lise alcalina, misturamos 15 µl de sílica. A mistura foi agitada por 5 minutos, sendo posteriormente centrifugada por 2 minutos, o sobrenadante resultante retirado e o pellet ressuspenso com 250 µl de etanol. A amostra foi centrifugada novamente por 10 minutos, o sobrenadante desprezado e o pellet lavado com etanol 70%. Posteriormente foi centrifugado mais uma vez, sendo o sobrenadante desprezado e o pellet seco a temperatura ambiente. Posteriormente o pellet foi ressuspenso com 20 µl de água milliQ, logo a amostra foi deixada a 56°C durante 5 minutos, e depois centrifugada por 2 minutos a 13000rpm. O sobrenadante resultante continha o DNA. A amostra foi posteriormente usada para PCR, como definido anteriormente.

12) Clonagem

Construções contendo genes alvos foram geradas a partir de produtos de PCR purificados por eletroeluição e clonadas em vetor Pgem T easy através de reação de ligação utilizando enzima ligase T4, produto de PCR purificado e 50ng de Pgem T easy. As ligações eram transformadas em células competentes (Escherichia coli DH5

α) e as bactérias transformadas analisadas. O plasmídeo vetor foi usado para verificação do tamanho do inserto, através de minipreparação de DNA e por meio de corrida eletroforética e/ou através de seqüenciamento.

Mapa circular do plasmídeo vetor pGEM-T e pontos de referencia na seqüência. 13) Preparação de bactérias competentes para transformação

As bactérias competentes (Escherichia coli DH5 α) foram preparadas utilizando- se o método de cloreto de cálcio (Sambrook e col.,1989) .Uma colônia bacteriana era inoculada em meio LB líquido e incubada durante a noite a 37 ºC com agitação. No dia seguinte 2 ml dessa cultura foram inoculados em um frasco contendo

200 ml de meio LB que foi incubado a 37 ºC com agitação até que a densidade óptica da cultura atingisse o valor de absorbância 600 nm + 0.4. A cultura era transferida para frascos estéreis e centrifugada a 8.000 xg por 5 min a 4 ºC.As células eram ressuspensas em 20 ml de CaCL2 50mM gelado, colocadas em gelo por 20 minutos e re-centrifugadas a 8.000 xg por 5 minutos a 4 ºC. Finalmente as células foram ressuspensas em 4 ml de CaCL2 50 mM gelado e mantidas no gelo no mínimo por 1 hora antes do uso. Por ocasião da transformação, 100 µl das células competentes eram transferidas a tubo eppendorf, adicionando-se a seguir as misturas de ligação contendo plasmídeos com os insertos de interesse. A suspensão era incubada por 1 hora no gelo. O choque térmico era gerado incubando-se as células por 2 minutos a 42 ºC e posteriormente, transferindo-se imediatamente o tubo de reação para gelo por 5 minutos. Foram adicionados à suspensão celular 900 µl de meio LB seguindo-se a incubação a 37 ºC por 1 hora com agitação. Em geral, como controle positivo da transformação empregava-se 50 ng de plasmídeo pTEX intacto não recombinante.

As células transformadas foram semeadas em placas petri contendo meio sólido LB-agar incluindo-se 100 µg/ml de ampicilina. As placas foram incubadas por 18 horas a 37 ºC e deixadas por algumas horas a 4 ºC.

As colônias foram removidas das placas, semeadas em LB líquido contendo 100 µg /ml de ampicilina. Os tubos foram incubados a 37 ºC por 18 horas. Após este período, as células foram utilizadas para extração de DNA plasmidial.