Desenho do Estudo e Procedimentos

3.5.1 Diagnóstico de Plasmodium vivax por gota espessa

O diagnóstico foi realizado através da gota espessa pela técnica de Walker (78), conforme a descrição do POP_MAL_LB_001_v02D_PT (Anexo 8.4.1) e avaliados por microscopistas especialistas da Fundação de Medicina Tropical Dr. Heitor Vieira Dourado. A densidade parasitária (parasitas/μL) foi calculada pela contagem do número de parasitas em 200 leucócitos.

3.5.2 Coleta do Material Biológico - sangue venoso

Na admissão, 20 mL de sangue total foi coletado para realização de hemograma (aparelho automatizado Coulter LH 750 Analyse da BECKMAN COULTER®), exames bioquímicos, como: bilirrubina total e frações, creatinina, fosfatase alcalina, glicose, TGO, TGP, GAMA GT e uréia (aparelho automatizado CT600i da WIENER LAB - GROUP) e estocagem para extração de RNA e DNA.

3.5.3 Dosagem Cloroquina mais Desetilcloroquina por HPLC

As análises foram realizadas no Laboratório de Toxicologia da Universidade Federal do

Pará em cromatógrafo líquido de alta eficiência Varian®, modelo PRO- STAR. A separação

cromatográfica foi realizada a temperatura ambiente empregando-se uma coluna X-TERRA®RP8

5μm 4.6 X 150mm (32).

3.5.4 Extração de DNA

Para extração de DNA foi utilizado o kit QIAmp® Blood Mini kit (Qiagen, Hilden, Germany) e realizado seguinte protocolo, sucintamente: 200μL de sangue com EDTA foram adicionados a 20 μL de proteinase K e 200 μL de tampão de lise. Após completa homogeneização em vórtex, a mistura foi incubada em banho-maria a 56°C por 10 minutos. Ao ser lisado foram adicionados 200 μL de etanol 96-100%, homogeneizado em vórtex por 5 segundos para a obtenção de uma solução homogênea. Para a purificação do DNA, a solução foi aplicada em coluna, que posteriormente lavada sucessivamente com dois tampões de lavagem. O DNA obtido foi eluído com 50 μL do tampão de eluição, conforme descrito no POP_MAL_LB_002_v01D_PT (Anexo 8.4.2). Em seguida, a confirmação de monoinfecção por P. vivax por PCR em tempo real.

3.5.5 qPCR

O método molecular utilizado para o diagnóstico do plasmódio baseia-se na amplificação do gene 18S rRNA (direcionada para uma detecção qualitativa de Plasmodium spp.)(79, 80). Os primers e sondas utilizados para amplificar região conservada deste gene do P. vivax e P. falciparum foram utilizados como descrito no POP_MAL_LB_003_v02D_PT (Anexo 8.4.3). As PCRs foram realizadas em reações de 20µL contendo 300 nM de cada primer, 200 nM de cada sonda, 10µL de master mix TaqMan PCR (Applied® Biosystems) e 3µL de DNA genômico no Applied® Biosystems 7500 Fast System, nas seguintes condições: 2 min a 50°C, 10 min a 95°C para ativar AmpliTaq Gold DNA polimerase, seguido de 45 ciclos de 15seg a 95°C e 1 min a 60°C. Em cada experimento, um poço apenas com mix foi incluído como controle negativo e realizado em duplicata.

3.5.6 Extração de RNA

As amostras foram tratadas com saponina e conservadas no reagente Trizol® até a extração conforme descrito no POP_MAL_LB_004_v01D_PT (81) (Anexo 8.4.4). Em resumo, foram adicionados 200 μL de clorofórmio, homogeneizado, incubado por 5-15 min e centrifugado a 12.000g por 15 min a 4°C. O sobrenadante foi transferido para um novo tubo com 500 μL de isopropanol, incubado por 10 min a temperatura ambiente e centrifugado a 12.000g por 10 min a 4°C. O sobrenadante foi descartado e lavado com 1mL de etanol a 75 %, depois centrifugado a 7.500g por 5 min 4°C. O pellet foi ressuspenso em 20 μL de H2O DEPC (pirocarbonato de dietilo) – água tratada sem RNase e deixado em termobloco a 65ºC por 5 min, agitou-se em um vórtex por 2 min e em seguida dado spin de vários segundos.

Para assegurar a qualidade do RNA foi realizado o gel de agarose a 2%. Para evitar que contaminação por DNA genômico pudesse interferir nos resultados, todas as amostras de RNA total foram tratadas com DNAse antes de serem submetidas ao RT-PCR (reação em cadeia da polimerase e transcriptase reversa), conforme as instruções do fabricante, DNAse I – Amplification Grade (Invitrogen®, EUA). Para a reação de transcrição reversa, foi utilizado o kit SuperScript III (Invitrogen®, EUA), conforme descrito no POP_MAL_LB_004_v01D_PT (Anexo 8.4.4).

3.5.7 Expressão gênica do pvcrt-o e pvmdr1

As reações de amplificação foram realizadas utilizando SYBR Green PCR Master Mix (Applied Biosystems) e 45 ng de cDNA de cada amostra como descrito no POP_MAL_LB_005_v01D_PT (Anexo 8.4.5). Os experimentos foram executados de forma independente e em triplicata. Os produtos de PCR foram amplificados usando Applied Biosystems® 7500 Fast System (73).

Para analisar os níveis de transcrição relativa, o valor do ciclo limite (Ct) de cada amostra foi utilizado para calcular e comparar o ΔCt de cada amostra do P. vivax do gene Sal I β-tubulina. O nível de expressão gênica foi calculado: N-fold = 2 - Δ Δ CT (82). A PCR foi realizada nas seguintes condições: desnaturação inicial a 95°C por 10 min, seguidos por 40 ciclos de 95°C por 15 seg e 60°C for 1 minuto.

3.5.8 Sequenciamento dos genes pvcrt-o e pvmdr1

Todas as amostras antes do tratamento (D0) e depois do tratamento (DR), em que houve recrudescência e suscetibilidade, foram utilizadas para pesquisar polimorfismos através de reações de sequenciamento de DNA. Os primers utilizados e as condições da reação usadas para amplificar as sequencias de pvcrt-o e pvmdr-1 estão descritos na (Tabela 1). As PCRs em reações de 50 µL contendo: 5 μL de tampão 10X, 2 μL de MgCl2 50mM, 1 mM de dNTP, 2,5 μM de cada primer, 0,25 μL de DNA polimerase e 8 µL de DNA genômico. Utilizando as seguintes condições no termociclador: desnaturação inicial a 95°C por 10 min, acompanhado de 35 ciclos de desnaturação 94°C por 50 seg, temperatura de anelamento específica de cada primer (60ºC e 44ºC para pvcrt-o e pvmdr-1, respectivamente) por 1 min e extensão a 72°C por 1 min.

Os produtos amplificados foram quantificados por NanoDrop^® 2000 (Thermo Scientific^®) e o sequenciamento foi realizado na Plataforma Tecnológica de Sequenciamento do Instituto Leônidas e Maria Deane – FIOCRUZ AMAZÔNIA. As sequências de aminoácidos foram comparadas com sequências do Sal I (Salvador I), alinhados e analisados usando software Geneious^® versão 6.0.

Tabela 1. Primers utilizados para avaliar polimorfismo na região promotora dos genes pvcrt-o

e pvmdr1.

Gene Cromosomo Sequência 5’ 3’ Pares bases

pvcrt-o 1 5’-TCA ACC CGA ATC CAA ACC AGT G-3’

5’-GGC CTG CCT TAC TCT CAT TCT G-3’

698

pvmdr1 10 5’-T ACT GCT GTT GCT ATT GTC CCT GGG-3’

5’-GAA TAT ATC ATT ATA CAG TGG-3’

1.002

3.5.9 Análise em marcadores moleculares, msp1F3 e MS2 em pacientes resistentes à CQ

O MS2 foi escolhido devido a sua alta diversidade genética demonstrado em estudos anteriores na América do Sul (83, 84) e o msp1F3, pois codifica uma região altamente polimórfica da MSP1 e apresenta baixa ocorrência de artefatos na PCR (83-85). A PCR foi executada como descrito por Koepfli et al. (86), com pequenas modificações, sendo realizado em reações de 20 µL contendo 10 µM de cada primer, 2 µL de tampão 10X, 2,5 mM dNTP,

25 mM MgCl2, 1,5 U Taq DNA polimerase e 5 µL DNA genômico (tabela 2). Foi diluído 3 µL do produto de PCR primário para ser utilizado como amostra na nested PCR (msp1F3 e MS2). A reação foi realizada em termociclador nas seguintes condições: desnaturação inicial a 95°C por 1 min, acompanhado de 29 ciclos (PCR primária) ou 24 ciclos (nested PCR) de desnaturação 95°C por 30 seg, anelamento a 59°C por 45 seg, extensão a 72°C por 1 min, acompanhada por extensão final a 72°C por 5 min. Em cada experimento, uma mistura sem DNA foi inclusa como controle negativo. Os produtos de PCR foram estocados e embalados em papel alumínio em abrigo da luz a 4°C até serem enviados para Macrogen®, onde foi realizado eletroforese capilar e analisados com GeneMarker® version 2.6.0.

Para assegurar a qualidade dos produtos de PCR foi realizado o gel de agarose a 2%. Os perfis eletroforéticos foram analisados para cada amostra em relação ao comprimento do amplicon e altura do pico. Os diferentes alelos detectados foram agrupados de acordo com o respectivo comprimento de repetição (msp1F3 -3 pb, MS2 -4 pb). Os picos abaixo de 150 bp não foram considerados, pois resultam de dímeros de primers residuais. O valor mínimo para a altura do pico foi definido como 500 unidades de fluorescência relativa. De acordo com a OMS, uma amostra é classificada como recrudescente se pelo menos um mesmo alelo for detectado no D0 e DR (87, 88) e como reinfecção se todos os alelos para um gene são distintos no D0 e DR (87).

Tabela 2. Oligonucleotídeos utilizados na genotipagem do P. vivax.

3.5.10 Variação do número de cópias (CNV)

A PCR foi realizada em triplicada no sistema StepOne^™ for Software and StepOne™ StepOnePlus™ Real-Time PCR Systems em placas de 96 poços e a amplificação gênica foi confirmada por três experimentos independentes. O gene contendo cópia única, β-tubulina, foi usado como referência (normalizador) (48, 67) e uma amostra de campo com uma única cópia

do gene alvo foi usado como calibrador. O método ΔΔCt foi usado para estimar o número de cópias dos genes pvmdr1 e pvcrt-o em relação a um gene calibrador padrão. As amostras foram consideradas como cópia única quando o valor estimado do número de cópias foi de 0,5 a 1,5, enquanto valores acima de 1,5 foram definidos como amplificação gênica. Somente amostras com CT - cycle threshold (definido como o número do ciclo da reação no qual a fluorescência gerada supera o limiar de fluorescência) entre 25-34 ou desvio padrão das triplicatas ≤ 0,3 foram consideradas nas análises (63).

As reações de amplificação foram realizadas em um volume total de 10 µL na presença de 5 µL de Taqman® Universal PCR Master MIX 2x (Applied Biosystems, AB, Foster City, CA, USA), 1 µL de DNA (~100-200 ng), 900 nM (pvcrt-o e pvmdr1) ou 300 nM (pvtubulin e pvcrt-o) para os iniciadores senso, 900 nM dos iniciadores anti-senso para todos os genes, e 200 nM (pvmdr1 e pvcrt-o) ou 250 nM (pvtubulin) para as sondas. Os iniciadores e sondas específicos para cada um dos genes estão descritos na (Tabela 3). Os parâmetros de ciclagem para a PCR foram as seguintes: desnaturação inicial a 95 °C por 10 minutos, 40 ciclos de 15 segundos a 95 °C e 1 minuto a 60 °C (63).

Tabela 3. Relação dos iniciadores e sondas utilizados na amplificação por PCR em tempo real

para determinação do número de cópias gênicas.

Locus Iniciador Referência

pvmdr1–F 5´-CAGCCTGAAAGATTTAGAAGCCTT Imwong et al., 2008 (67) pvmdr1–R 5´-CGGCTGTTGGAATCACTTTGA pvmdr1–probe 5´CGGAGGAGTCGAACGAAGATGGTTTTTCTT pvtubulin–F 5´-TCGCTTAACGACGTCCCC pvtubulin–R 5´-TGGAATGTCACAAACGCTGG pvtubulin– probe 5´-TTCCGCTTCCCCCTCCACAGG pvcrto–F 5´-TTTGGTCGCCGGGTCAT

pvcrto–R 5´-CAGCAGCGAGATTAGCAAAAATT Costa et al., 2017 (63) pvcrto-probe 5´-TGTTTAACCTCGTGTTGATTGCCTCGC