2. HIPÓTESE
5.5. Desenho de primers e RT-PCR
Primers para os mRNAs referentes ao HDAC4, SRF, Pax7 e Sox6 foram desenhados a partir de sequências de Danio rerio publicadas no NCBI (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/nucleotide/) (números de acesso: HDAC4 – NM_001039358.2; SRF – NM_001110526.1; Pax7 – AF014367.1; Sox6 – NM_001123009.1). Esses primers foram utilizados para amplificação dos cDNAs obtidos do músculo esquelético do pacu, pela técnica de RT-PCR (PCR tradicional). A cada 1 µL de cDNA foram adicionados 0,5 µL de Primer
Forward (10 µM), 0,5 µL de Primer Reverse (10 µM), 0,5 µL de UltraPureTM Distilled Water
DNAse, RNAse Free (Life Technologies, USA) e 22,5 µL de Platinum® PCR Supermix (Life
Technologies, USA), em um volume final de 25 µL de solução. Os produtos da reação foram sequenciados no ABI 3500 Genetic Analyzer® (Life Technologies, USA), utilizando-se os
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procedimentos do BigDye® Terminator v.3.1 Cycle Sequencing kit (Life Technologies, USA). Cada sequência nucleotídica parcial obtida foi analisada através da ferramenta BLAST (http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi), para confirmar o fragmento amplificado com aqueles já publicados provenientes de outros peixes teleósteos. Primers para os mRNAs referentes à MyoD, Miogenina e 18S foram desenhados a partir de sequências de Piaractus mesopotamicus publicadas no NCBI (números de acesso: MyoD – FJ686692.1; Miogenina – FJ810421.1; 18S – GQ337002.1). As sequências parciais dos mRNAs HDAC4, SRF, Pax7, Sox6, MyoD, Miogenina e 18S provenientes do pacu foram utilizadas para o desenho de primers específicos para a PCR em Tempo Real, através do software Primer Express 3.0.1.® (Life Technologies, USA).
5.6. PCR em Tempo Real
Os níveis de expressão dos miRNAs e mRNAs foram detectados por PCR em Tempo Real, através da plataforma QuantStudio¥ 12K Flex Real-Time PCR System (Life Technologies, USA). Os níveis de expressão foram normalizados pelo RNA ribossomal 18S, cuja expressão foi constante entre todas as amostras, e a quantificação relativa da expressão foi realizada pelo método 2-∆∆Ct (Livak & Schmittgen, 2001). Para que esse método de quantificação relativa pudesse ser utilizado, foi necessário fazer sua validação, determinando se a eficiência de amplificação dos genes alvo é similar à eficiência de amplificação do gene endógeno. A análise dessas eficiências de amplificação foi feita através da Curva-Padrão (CP), composta por uma série de 7 diluições (1:10) a partir de uma solução inicial que continha cDNA das amostras musculares de todos os animais. O gráfico da CP apresentou 7 pontos e o grau de sua inclinação forneceu uma estimativa da eficiência de amplificação dos primers. A eficiência da reação de cada gene foi calculada pela seguinte fórmula: E = (10-1/slope – 1) x 100, em que E = eficiência da reação expressa em %, e slope = valor do ângulo de inclinação da reta no gráfico. Um slope de -3.32 indica que a reação de amplificação teve 100% de eficiência, ou seja, a cada ciclo de PCR foi gerado o dobro do número de moléculas do ciclo anterior. Como os valores de slope foram aceitáveis (entre -3.8 e -3.3) (Patruno et al., 2008), as eficiências de amplificação para os genes alvo e endógeno foram adequadas e o método 2-∆∆Ct pôde ser aplicado.
Cada amostra de cDNA correspondente aos miRNAs foi amplificada através dos ensaios
TaqMan® Universal PCR Master Mix (Life Technologies, USA) e TaqMan® MicroRNA Assays
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miR-133a, miR-133b, miR-206 e miR-499 (Tabela 2). Seguindo as orientações do protocolo, foram utilizados 1,3 µL de cDNA, 1 µL de TaqMan® MicroRNA Assays, 10 µL de TaqMan®
Universal PCR Master Mix e 7,7 µL de UltraPureTM Distilled Water DNAse, RNAse Free (Life
Technologies, USA), totalizando um volume final de 20 µL de solução. Com relação aos mRNAs HDAC4, SRF, Pax7, Sox6, MyoD, Miogenina e 18S, as amostras de cDNA foram amplificadas utilizando-se o Fast SYBR® Green Master Mix (Life Technologies, USA) e primers sintetizados pela Life Technologies (USA), que foram desenhados através do software Primer
Express 3.0.1.® (Life Technologies, USA) (Tabela 3). Os primers foram diluídos em
UltraPureTM Distilled Water DNAse, RNAse Free (Life Technologies, USA) e suas
concentrações ajustada para 5 µM. Conforme instruções do fabricante, foram utilizados 2 µL de cDNA, 2 µL de Primer Forward, 2 µL de Primer Reverse, 12,5 µL de Fast SYBR® Green
Master Mix (Life Technologies, USA) e 6,5 µL de UltraPureTM Distilled Water DNAse, RNAse
Free (Life Technologies, USA), totalizando um volume final de 25 µL de solução.
As reações foram realizadas em duplicata, nas seguintes condições: 95ºC por 10 minutos, seguido por 40 ciclos de desnaturação a 95ºC por 15 segundos e anelamento/extensão a 60ºC por 1 minuto. Para cada amostra foi gerado um gráfico de amplificação, que mostra o aumento da fluorescência (∆Rn) ao longo de cada ciclo da PCR. Para as amostras amplificadas com o Fast
SYBR® Green Master Mix (Life Technologies, USA), foi feita a análise da Curva de Dissociação
dos fragmentos ao término de cada PCR, um passo de 20 minutos em que a temperatura da reação aumenta gradualmente de 60 para 95ºC. O gráfico resultante permite detectar a presença de um ou mais produtos amplificados, pois produtos com diferentes tamanhos desnaturam em diferentes temperaturas, gerando mais de um pico de fluorescência. Dessa forma, a Curva de Dissociação possibilitou a avaliação da especificidade de amplificação de cada conjunto de primers, confirmada pela presença de um único pico de fluorescência.
Ao término de uma reação de PCR são necessários ajustes do baseline e threshold sobre os gráficos de amplificação, para uma análise exata dos dados de expressão. Baseline é o parâmetro correspondente ao nível basal de fluorescência emitida nos primeiros ciclos da PCR, antes do surgimento das curvas de amplificação. Deve-se estabelecer a faixa de ciclos correta do
baseline, pois seu valor será subtraído do sinal fluorescente das curvas de amplificação. Threshold é o limiar de detecção de fluorescência, fixado para a obtenção de um valor de Ct para
cada animal e posicionado na região exponencial da curva de amplificação, local onde a eficiência da PCR é maior. Foi adicionado um controle negativo para cada gene nas placas de
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reação e, após ajuste dos parâmetros, foram obtidos valores de Ct para cada animal, tanto referentes aos genes alvo quanto ao gene endógeno. Após obtenção do Ct médio das duplicatas, foi calculado o valor de ∆Ct (Ctgene alvo – Ctgene endógeno) e de ∆∆Ct (∆Ctamostra – ∆Camostra calibradora).
A amostra calibradora corresponde a um animal controle ou um estágio particular do desenvolvimento, sendo utilizada como base para comparação dos resultados. Para os dados de peso e comprimento e durante o crescimento do músculo de contração rápida, nós utilizamos a amostra com menor valor de expressão do grupo 30 dias como calibradora. A amostra com menor valor de expressão do grupo 150 dias foi utilizada como calibradora para os dados durante o crescimento do músculo de contração lenta e entre as musculaturas de contração rápida e lenta. Para os dados das culturas de mioblastos, nós utilizamos a amostra com menor valor de expressão do grupo 2-4 dias como calibradora. A quantificação relativa dos dados de expressão foi calculada pela fórmula 2-∆∆Ct (Livak & Schmittgen, 2001), expressa em fold-change.
5.7. Análises estatísticas
As análises estatísticas do peso e comprimento dos pacus, dos dados de expressão durante o crescimento do músculo de contração rápida e dos dados das culturas de mioblastos foram realizadas pelo teste paramétrico one-way ANOVA, seguido pelo teste de comparações múltiplas de Tukey. O teste t não pareado foi utilizado para os dados de expressão durante o crescimento do músculo de contração lenta e entre as musculaturas de contração rápida e lenta dos pacus de 150 dias e 2 anos. O nível de significância adotado foi de 5% (GraphPad Prism 5 Software, USA).
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7. ARTIGO
Differential microRNA expression in fast- and slow-twitch skeletal muscle of Piaractus
mesopotamicus during growth.
Bruno Oliveira da Silva Duranand Maeli Dal-Pai-Silva
Abstract
Pacu (Piaractus mesopotamicus) is a Brazilian fish with high economic interest for pisciculture due to features such as rusticity and fast growth. Postnatal growth of skeletal muscle in fish occurs by hyperplasia and/or hypertrophy, processes that are dependent on the proliferation and differentiation of myoblasts. A class of small noncoding RNAs, known as microRNAs (miRNAs), represses the expression of target mRNAs, and many studies demonstrate that miR-1, miR-133, miR-206 and miR-499 regulate different processes in skeletal muscle through the mRNA silencing of HDAC4, SRF, Pax7 and Sox6, respectively. The aim of our work was to evaluate the expression of miRNAs and their putative target mRNAs in fast- and slow-twitch skeletal muscle of pacu during growth. Our results revealed an inverse correlation between the expression of miRNAs and their target mRNAs, and there was evidence that miR-1, miR-133 and miR-206 may regulate the proliferation and differentiation of myoblasts. On the other hand, miR-499 was highly expressed in slow-twitch muscle, which suggests its involvement in the specification and maintenance of the slow phenotype in muscle fibres. miRNA expression exhibited variations between different development stages and between distinct muscle twitch phenotypes. This work provided the first identification of miRNA expression profiles related to skeletal muscle in pacu and suggests an important role of these molecules in this tissue.
Keywords: Pacu (Piaractus mesopotamicus), Skeletal muscle, MicroRNA, Myogenic regulatory
factors (MRFs).
Introduction
Piaractus mesopotamicus, popularly known as pacu, is an important economically
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meat, reaching up to 20 kilograms (Santos et al., 2012). Roundfish represent the majority of native fish farmed, accounting for about 33.5% of national production, and have high market value to Brazilian fishery and pisciculture (MPA, 2013). Although zebrafish (Danio rerio) and medaka (Oryzias latipes) are widely used as model organisms for the understanding of many biological processes, there are limitations in the study of muscle during fish growth, because these animals reach small sizes (Froehlich et al., 2013). Pacu is an excellent experimental model for this kind of study because of its large body size, indicating that, in addition to its high economic interest, it also exhibits importance for scientific research.
In most fish, skeletal muscle constitutes ~60% of body mass and comprises two major fibre types: fast-twitch muscle fibres, which comprise the edible part of the fish, and slow-twitch muscle fibres (Sänger & Stoiber, 2001; Almeida et al., 2010). Postnatal muscle growth in fish involves cells localized at the periphery of muscle fibres, known as satellite cells. These cells give rise to myoblasts, whose proliferation and differentiation are the mechanisms that promote hyperplasia (increase in muscle fibres number) and hypertrophy (increase in muscle fibre size) (Rowlerson & Veggetti, 2001; Johnston et al., 2011), processes regulated by several transcription factors, such as myogenic regulatory factors (MRFs). MRFs include MyoD, which regulates the activation and proliferation of myoblasts, and Myogenin, which is involved in the differentiation and fusion of these cells (Johansen & Overturf, 2005; Almeida et al., 2010).
Small noncoding regulatory RNAs, such as microRNAs (miRNAs), also play an important role in vertebrate muscle development. The primary function of miRNAs is the post- transcriptional gene regulation, through the translational inhibition and decay of messenger RNAs (mRNAs) (Ge & Chen, 2011). Combinatorial regulation is a common feature; a miRNA may have several target mRNAs and, similarly, a single mRNA can be targeted by different miRNAs. Thus, miRNAs promote an orchestrated regulation of their targets, controlling signaling pathways and common biological functions (van Rooij et al., 2008; Goljanek-Whysall
et al., 2012). Some miRNAs are specifically or highly expressed in cardiac and/or skeletal
muscles and therefore are called muscle-specific. miR-1, miR-133, miR-206 and miR-499 are involved in several processes in skeletal muscle, like myogenesis, proliferation and differentiation of myoblasts, specification of fibre types and muscle regeneration (Chen et al., 2006; van Rooij et al., 2009; Ge & Chen, 2011).
Many studies and bioinformatics approaches have demonstrated that miR-1, miR-133 and miR-206 silence genes involved in muscle growth, like HDAC4 (histone deacetylase 4), SRF
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(serum response factor) and Pax7 (paired box protein 7), respectively (Chen et al., 2006; Williams et al., 2009; Chen et al., 2010; Goljanek-Whysall et al., 2012). In mammals, miR-1 and miR-206 mainly promote the differentiation of myoblasts, whereas miR-133 stimulates the proliferation of these cells. miR-499 targets Sox6 (SRY-box containing gene 6), a molecule that acts in the definition of fast-twitch muscle fibres phenotype (McCarthy et al., 2009; van Rooij et
al., 2009). Wang et al. (2011) demonstrated in zebrafish that translational repression of Sox6 is
mediated by miR-499, revealing the participation of this miRNA in the maintenance of slow- twitch muscle fibres phenotype.
Studies that aim to clarify the molecular mechanisms involved in muscle growth of pacu may contribute to improvements in its intensive farming, because they are directly related to the increase of muscle mass and meat quality. We hypothesized that miRNAs may be involved in the regulation of skeletal muscle growth and twitch phenotypes in pacu. The aim of our work