DESENVOLVIMENTO DAS NP CONTENDO VANCOMICINA

Os resultados necessários para a avaliação e seleção da melhor combinação das condições de preparação das NP de PCL contendo VAN foram reunidos na Tabela 3. Como diversos parâmetros afetam sobremaneira as propriedades físico-químicas das nanopartículas, a otimização das condições experimentais representa uma etapa crítica do desenvolvimento do método de produção (QUINTANAR-GUERRERO, 1996; MOSQUEIRA et al., 2000; FALCONER et al., 2012). É sabido, por exemplo, que os diâmetros das nanoparticulas de PLGA e a concentração do fármaco foram significativamente alterados quando preparadas com dimetilacetamida (DMAc), dimetilformamida (DMF) e dimetilsulfóxido (DMSO), em um estudo que avaliava o uso de diferentes solventes no início do processo de produção (JEON et al., 2000). Deste modo, as variáveis – razão polímero/ativo, tempo de ultrassom e volume de solvente orgânico – foram estudadas e seus efeitos sobre as respostas tamanho de partícula, polidispersão, concentração de VAN e EE% das NP de PCL foram analisados (Figura 6).

Tabela 3 – Respostas tamanho de partícula, polidispersão, concentração de VAN e EE% das NP de PCL de acordo com ensaios sugeridos pelo planejamento experimental 23-1 + 3(C).

Ensaio No Nanoformulação Forma

Física Tamanho de Partícula* (nm) Polidispersão* Concentração de VAN* (mg/g NP) EE%* sc 280,7±6,2 0,129±0,028 lf 456,3±8,6 0,259±0,016 sc 369,6±7,4 0,174±0,013 lf 1004,9±23,1 0,349±0,011 sc 419,2±5,6 0,263±0,010 lf 936,5±50,5 0,325±0,013 sc 446,6±8,1 0,297±0,013 lf 678,1±11,6 0,354±0,012 sc 287,4±3,7 0,185±0,016 lf 412,0±4,9 0,197±0,022 sc 355,9±3,1 0,236±0,037 lf 488,3±9,1 0,180±0,035 sc 347,5±15,3 0,079±0,028 lf 1100,4±87,7 0,301±0,034 sc 369,6±10,2 0,129±0,060 lf 1183,4±24,0 0,330±0,018 sc 281,9±4,7 0,141±0,027 lf 572,1±28,1 0,325±0,001 sc _277,4±5,3a _0,054±0,008 lf 446,8±8,7 0,224±0,019 sc 281,7±2,2 0,095±0,027 lf 551,8±18,6 0,305±0,027 sc _243,8±2,3a 0,100±0,027 lf 764,8±31,0 0,355±0,016 sc 249,1±2,9 0,096±0,007 lf 621,7±14,2 0,336±0,010 sc _247,1±3,1a 0,026±0,032 lf 601,6±30,2 0,307±0,010 100,5±0,8 Branco Branco 6 (C)a 7 (C)a 90,1±0,1 103,7±7,9 99,8±0,3a 93,9±0,8a Branco VAN 2 Branco Branco Branco VAN VAN VAN 5 (C)a 1 3 VAN VAN 83,4±0,4 Branco VAN 110,0±0,0a

*Média ± Desvio Padrão; NP: nanopartícula; EE%: Eficiência de Encapsulação; VAN: vancomicina encapsulada; (C): ponto central; sc: suspensão coloidal e lf: liofilizado; ap -valor < 0,05 (ANOVA).

7,2±0,02a 6,9±0,06a 8,0±0,00a 11,8±0,06 7,3±0,06 15,1±1,15 6,15±0,01 4

A análise das respostas do planejamento experimental expostas na tabela 3 indicou que o terceiro ensaio reúne a combinação de condições ideais para produzir as PCL-NP pelo método de múltipla emulsificação (água/óleo/água) com difusão do solvente. A melhor

concentração de VAN encapsulada foi de 15,1 ± 1,2 mg/g NP, considerando uma faixa de EE% entre 83,4% e 110% e com menor tamanho de partícula (488,3 ± 9,1 nm) e polidispersão (0,180 ± 0,035).

As NP liofilizadas apresentaram diâmetro de partícula entre 412,0 e 1183,4 nm com ou sem o antimicrobiano. A quantidade de polímero utilizado afetou diretamente o diâmetro médio das NP, uma vez que aquelas preparadas utilizando o maior nível do planejamento experimental (A = +1) da variável razão PCL/VAN (ensaios 2 e 4) foram 1,2 vezes maiores que as preparadas no menor nível (A = –1) (tabela 2 e 3). Tais resultados estão de acordo com trabalhos anteriores aplicando a técnica de dupla emulsificação, onde o tamanho de partícula aumenta com o acréscimo do volume de polímero (YANG et al., 2001) e com a incorporação do ativo (LE RAY et al., 2003; IMBULUZQUETA et al., 2011). Neste trabalho observa-se também (Tabela 3) grandes aumentos no tamanho das partículas que alcançam a escala de 1µm após a liofilização, sugerindo que o crioprotetor manitol ou sua concentração utilizada durante processo de preparação das NP não foi capaz de evitar a aglomeração entre elas, dificultando o dimensionamento real do diâmetro das partículas. Conforme descrito por outros autores, a adição de agentes crioprotetores aos sistemas nanoparticulados induz o acondicionamento irregular das moléculas na massa vítrea intersticial durante a fase de congelamento que ocorre no processo de liofilização, produzindo um grande espaço interior, que promove a diminuição da densidade em comparação com a massa mais ordenada construída por cristais de gelo. Deste modo, a agregação de NP ou qualquer alteração em função da pressão desenvolvida pelo crescimento de cristais é evitada (CHASTEIGNER et

al., 1996; HANCOCK e ZOGRAFI, 1997; YU, 2001). Entretanto, Saez e colaboradores

(2000) investigaram a habilidade crioprotetora de aditivos como sacarídeos, poliálcoois e compostos de alto peso molecular durante a etapa de liofilização de nanopartículas de PLGA e PCL e evidenciaram que o uso de 30% de manitol também não foi efetivo na preservação das características destas NP, isto é, permitiu a formação de agregados macroscópicos que poderia ter sido influenciada pela conformação molecular ou estereoquímica deste poliálcool.

Ainda em relação ao tamanho das nanopartículas, tão importante quanto a determinação do valor médio do diâmetro é a medida de sua dispersão. A homogeneidade no diâmetro das partículas pode ser avaliada pelo índice de polidispersão, o qual indica a distribuição média do tamanho, sendo valores menores que 0,200 considerados bons indicadores de homogeneidade (MELO et al., 2010). Estes valores são desejados para manter a estabilidade da dispersão coloidal sem a formação de micropartículas ou precipitados. As NP liofilizadas com ou sem a incorporação da VAN apresentaram um valor médio de

polidispersão entre 0,180 e 0,355, evidenciando a homogeneidade das NP contendo VAN obtidas com a combinação de variáveis do ensaio 3.

Todos os valores de eficiência de encapsulação (EE%) calculados foram superiores a 80% corroborando com a eficácia da técnica de emulsão múltipla em limitar a difusão de fármacos hidrossolúveis na fase externa aquosa (VRIGNAUD et al., 2011). As mais altas EE% corresponderam com as maiores concentrações de VAN utilizadas, o que ocorreu quando as NP foram preparadas empregando-se o nível inferior do planejamento experimental (A = -1), sugerindo uma relação entre as variáveis estudadas, ou seja, quanto menor a razão PCL/VAN, maior a EE%.

Empregando-se a análise estatística as suspensões coloidais de PCL-NP contendo VAN pode-se observar que todas as respostas, com exceção da polidispersão, foram significativamente diferentes (p-valor < 0,05, ANOVA) entre os pontos centrais 5, 6 e 7 do planejamento fatorial fracionado, sugerindo a não reprodutibilidade da técnica de emulsão múltipla. O trabalho de Cazo et al. (2012) pode justificar tal questionamento, uma vez que através de um planejamento fatorial 23 foram formulados e aperfeiçoados os processos e parâmetros para nanoencapsulamento da hidrocortisona em PCL e em seguida, foi evidenciada a repetibilidade da técnica de nanoprecipitação das NP em suspensão coloidal preparando três amostras idênticas no ponto central e submetendo os resultados à análise de variância (ANOVA).

Nem todos os efeitos principais considerados neste estudo apresentaram correlações com as respostas testadas, como demonstrado no Diagrama de Pareto (Figura 6), o que pode significar que algumas variáveis não examinadas desempenharam efeito importante ou que muitas variáveis foram examinadas para uma dada resposta. Como p=0,05 representa o nível de significância do teste (α = 0,05), todas as variáveis cujos p-valores foram menores que α foram rejeitadas. Deste modo, os efeitos principais das variáveis tempo de ultrassom (TUS) e volume de solvente orgânico (VOL DCM) não foram significativos para nenhuma das respostas analisadas (A), (B) e (C), enquanto que o efeito principal da variável razão polímero/ativo (PCL/VAN) apresentou-se significativo (p-valor < α) para a resposta concentração de vancomicina encapsulada (D).

Figura 6: Diagrama de Pareto – Efeito principal das variáveis sobre as respostas (A) Tamanho de partícula, (B) Polidispersão, (C) Eficiência de Encapsulação e (D) Concentração de vancomicina encapsulada (mg/g).

A análise das superfícies de resposta (Figura 7) evidencia que o efeito principal razão PCL/VAN 1:2 (p/p) foi significativo, influenciando o aumento da concentração de VAN encapsulada. Condições ótimas foram atingidas com o uso de 5 mL de solvente orgânico (I) e empregando 9 minutos de homogeneização no ultrassom (II).

Figura 7: Superfícies de resposta para a concentração de vancomicina encapsulada (Cvan) (mg/g NP) em função da razão polímero/ativo (PCL/VAN) e volume de solvente orgânico (VOL DCM) (I) e da razão polímero/ativo (PCL/VAN) e tempo de ultrassom (TUS) (II).

Baseando-se nos resultados das condições experimentais para formar PCL-NP otimizadas contendo VAN, PLGA-NP foram produzidas para realização de um estudo comparativo. Neste contexto, as variáveis usadas seguiram os parâmetros estabelecidos no terceiro ensaio do planejamento experimental, como foi mostrado previamente. A tabela 4 apresenta os principais resultados obtidos através das análises do tamanho de partícula, polidispersão, concentração de VAN encapsulada e EE%, mostrando que houve diferença

significativa entre as NP produzidas com os diferentes polímeros (p-valor < 0,05; ANOVA). Análises realizadas com o teste t-Student revelaram que não houve diferença significativa entre as PLGA-NP com ou sem VAN (p = 0,6651, p-valor > 0,05), ao contrário do observado com as PCL-NP otimizadas (p < 0,0001, p-valor <0,05).

Tabela 4 – Respostas tamanho de partícula, polidispersão, concentração de VAN e EE% das PLGA-NP reproduzidas de acordo com o ensaio 3 do planejamento 23-1 +3 (C)

Nanoformulaçãot Tamanho de Partícula* (nm) Polidispersão* Potencial Zeta(mV)* Concentração de VAN* (mg/g NP) EE%* Branco 218,1 ± 4,12 0,388 ± 0,030 h-20,9 ± 0,8 VAN 226,0 ± 29,03 0,202 ± 0,021 h-18,4 ± 0,8 15,7±1,2 107,3±8,3

*Média ± desvio padrão; EE%: Eficiência de Encapsulação; VAN: vancomicina encapsulada; tp -valor

> 0,05, teste t -Student

Outro parâmetro fundamental na avaliação da estabilidade da suspensão coloidal é a determinação de potencial zeta. Quando nanopartículas são preparadas em solução, ocorre a formação de uma dupla camada eléctrica que rodeia as nanopartículas. O potencial zeta ou o potencial eletrostático neste limite "plano de cisalhamento hidrodinâmico" está relacionado com a carga da superfície das nanopartículas (SCHAFFAZICK et al., 2003; CLOGSTON e PATRI, 2011) e indica o grau de repulsão entre partículas semelhantes em uma dispersão (MANZANILLA-GRANADOS et al., 2011). As suspensões coloidais de PLGA-NP e VAN PLGA-NP, apresentaram respectivamente, os valores de potencial zeta de -20,9 mV e -18,4 mV, que são considerados altamente estáveis no meio de dispersão (WU et al., 2011; CLOGSTON e PATRI, 2011)

5.2. CARACTERIZAÇÃO DAS NANOPARTÍCULAS (NP)

Os espectros de infravermelho (IV-TF) da VAN livre, PCL-NP e VAN PCL-NP estão apresentados na figura 8. As NP apresentaram espectros com bandas em 2938 e 2939 cm-1 correspondendo a vibrações simétricas e assimétricas do grupo CH2 e a vibração éster C=O ocorre a 1721 cm-1. As vibrações da banda CH2 do polímero estão presentes a 1383, 1453 e 1454 cm-1 e as vibrações éster COO ocorrem a 1170 e 1261 cm-1. O alongamento da banda CH2 da VAN a 2880 cm-1 não foi observada no espectro da VAN PCL-NP possivelmente em

função da sobreposição da molécula do antimicrobiano durante a formação da nanopartícula. As bandas em 1107, 1053, 933 e 938 cm-1 são devidas às vibrações O-C com vibrações CH2 ocorrendo a 713 e 714 cm-1(SUGANYA et al., 2011; CHELLAMANI et al., 2013). A banda de absorção da VAN a 3398 cm-1 é atribuída ao grupo terminal hidroxila e a 1655 cm-1 é devido ao estiramento da ligação C=O. A banda a 1230 cm-1 está relacionada ao alongamento assimétrico COC. A banda a 1295 cm-1 tem sido reportada na literatura como sendo relacionada à mudança na cristalinidade do PCL (MA et al., 2010). Outras bandas características do espectro da VAN aparecem a 1499, 1230, 1126-1062 cm-1 correspondendo às vibrações C=C, C-O-C e C-N-H, respectivamente. A banda de vibração CH2 da VAN está presente a 1423 cm-1. Estes resultados sugerem que VAN foi encapsulada na nanopartícula, apesar da banda de absorção a 3854 cm-1 atribuída ao grupo N-H ter sido brevemente observada no espectro VAN PCL-NP, sugerindo que parte da molécula de VAN pode não estar totalmente incorporada. Nesse sentido, o trabalho de Mohammadi e colaboradores (2010) que realizou análise de IV-TF da mistura física entre polímero e antimicrobiano revelou que no espectro da mistura física picos correspondentes a azitromicina são vistos com menor intensidade e aqueles correspondentes ao PLGA são diferentes aos dos espectros das nanopartículas. Do mesmo modo, o espectro do complexo de inclusão de um óleo essencial pela ciclodextrina no trabalho de Falcão e colaboradores (2011) demonstrou mudanças importantes na região de alongamento do grupo OH que não foram visíveis no espectro da mistura física.

Figura 8: Espectros de infravermelho (IV-TF) da vancomicina livre (VAN), nanopartículas de PCL contendo vancomicina (VAN PCL-NP) e das nanopartículas de PCL sem o fármaco (PCL-NP).

Os espectros de IV-TF gerados pela VAN, VAN PLGA-NP e PLGA-NP estão representados na figura 9. Com relação aos polímeros, as bandas características dos alongamentos simétricos e assimétricos dos grupos CH2 e CH3 estão visíveis a 2959 e 2935 cm–1. Seguindo o mesmo comportamento, bandas de deformação assimétrica CH3 são observadas a 1377 cm–1 e CH2 a 1452 cm

–1

. A 1760 cm–1, é vista uma discreta banda causada pelo estiramento de ligação C=O, típica dos ésteres. As bandas a 1185, 1088 e a 1087 cm–1 são conhecidas como sendo relacionadas ao alongamento C-O de poliésteres alifáticos (MARQUES et al., 2013). Conforme Imbuluzqueta e colaboradores (2011), se não foram observadas mudanças significativas nem o desaparecimento ou o aparecimento de novas bandas, é possível que o espectro das VAN PLGA-NP seja o resultado da sobreposição do polímero com o antibiótico, com ausência de interações significativas fármaco:polímero no estado sólido. 1261 cm-1 COO 1170 cm-1 _(COO) 1721 cm-1 C=O 3398 cm-1 _(O–H) 3854 cm-1 (N–H) 2880 cm-1 (CH2)

Figura 9: Espectros (IV-TF) da vancomicina livre (VAN), nanopartículas de PLGA contendo vancomicina (VAN PLGA-NP) e nanopartículas de PLGA sem o fármaco (PLGA-NP).

Como forma de obter informações sobre as propriedades físicas, como a natureza cristalina ou amorfa das amostras e de investigar as possíveis interações entre os componentes das NP produzidas, análises de (DSC) foram realizadas. Analisando o termograma da VAN PCL-NP (Figura 10A), foi possível observar um pequeno deslocamento da sua temperatura de transição vítrea (Tg) para um valor intermediário, acima daquele apresentado pelo PCL-NP e abaixo do apresentado pela VAN livre, sugerindo uma interação física entre o polímero e o antimicrobiano. O mesmo comportamento não é observado no termograma da amostra de VAN PLGA-NP (Figura 10B), isto é, não é visível um pico referente à Tg intermediária em relação às outras amostras, sugerindo ausência de interação entre fármaco e polímero. Este dado pode ser confirmado com a análise do espectro IV-TF das VAN PLGA-NP, no qual não se observa nem o desaparecimento ou o aparecimento de novas bandas. Ainda, há de se considerar que não se sabe até que ponto estas interações entre os componentes de uma amostra podem afetar as características de produtos liofilizados (SAEZ et al., 2000), tornando fundamental a realização de outras técnicas de análise para investigar prováveis alterações das propriedades físicas das partículas e do ativo encapsulado.

1760 cm-1 (C=O) 1087 cm-1 (C–O) 1088 cm-1 (C–O) 1185 cm-1 (C–O)

Na taxa de aquecimento (10oC/min) utilizada neste estudo, a amostra de VAN apresentou um pico exotérmico a 131,26 oC correspondendo ao seu ponto de fusão e entalpia de 345,8 J/g. Na amostra de VAN PCL-NP houve um decréscimo do ponto de fusão (84,85oC) e da entalpia (19,95 J/g), indicando presença do estado amorfo de VAN nas NP (KUSUM et al., 2009). Já com relação ao termograma das VAN PLGA-NP (Figura 10B), como o pico exotérmico da VAN não foi observado, pode-se afirmar ausência da substância livre no estado cristalino. Assim, uma vez que ambos os termogramas de NP exibiram a VAN na fase amorfa, pôde-se confirmar os resultados observados nos espectros de IV-TF gerados pela VAN e NP poliméricas, sugerindo que o fármaco está homogeneamente disperso na matriz polimérica.

Figura 10: Termogramas de DSC da VAN livre, PCL-NP e VAN PCL-NP (A) e VAN livre, PLGA-NP e VAN PLGA-NP (B).

5.3. AVALIAÇÃO DO PERFIL DE LIBERAÇÃO DO ATIVO EM MODELO IN VITRO

A cinética de liberação in vitro da VAN encapsulada com PLGA (Figura 11) apresentou um padrão bifásico, com um burst inicial durante as primeiras 2 horas, o que pode ser atribuído à ausência de interação física entre o antibiótico e o polímero indicado pelas análises do espectro de IV e do termograma DSC, seguido por um lento e controlado perfil de liberação que pode ser acompanhado por até 4,5h. Além disso, as características hidrofílicas da formulação podem favorecer uma solubilização e erosão mais rápida da matriz polimérica, em vez de uma degradação mais gradativa, comum às formulações hidrofóbicas, e que resulta em um burst secundário (LI et al., 2001).

Figura 11: Perfil de liberação in vitro das nanopartículas de PLGA contendo VAN.

5.4. AVALIAÇÃO DA ATIVIDADE ANTIBACTERIANA IN VITRO

A preservação da atividade biológica de formulações farmacêuticas configura um grande problema, uma vez que a instabilidade (alterações químicas, desnaturação) pode

ocorrer no processo de produção, assim como durante a liberação da forma farmacêutica. A atividade de novas formulações contendo VAN foi avaliada frente ao S. aureus, através da determinação da sua concentração inibitória mínima (MIC). Os resultados obtidos foram reunidos na tabela 5. As MIC das diferentes NP poliméricas contendo VAN foram idênticas as do composto de referência (cloridrato de vancomicina). Estes resultados demonstram que a atividade antimicrobiana da VAN foi mantida, independente das condições do processo de produção e da encapsulação nas diferentes NP poliméricas. Com relação as NP de PCL e PLGA sem o antibiótico, estas não apresentaram atividade contra o inóculo bacteriano (acima de 128 µg/mL), o que sugere que a atividade antimicrobiana dos diferentes tratamentos foi nitidamente atribuída à fração de VAN. Observando resultados de outros pesquisadores, verificamos, por exemplo, que micropartículas produzidas pelo método de emulsão simples a base de PCL carreando VAN também apresentaram atividade bactericida semelhante à da VAN livre quando foram testadas frente a cepas de MRSA (LE RAY et al., 2005). E que, por outro lado, o ciprofloxacino liberado de NP de PLGA desenvolvidas por Jeong e colaboradores (2008) pelo método de dupla emulsificação por evaporação do solvente demostraram atividade antimicrobiana inferior a do antibiótico livre frente à Escherichia coli, utilizando o mesmo ensaio in vitro. Apesar disso, a utilização do ensaio in vitro de avaliação da atividade antimicrobiana com NP carreadoras de VAN requer estudos mais aprofundados que comprovem as vantagens já descritas destes novos sistemas de distribuição de fármacos frente a substancia livre, além de pesquisas sobre a toxicidade celular e a eficácia destas formulações em modelos in vivo.

Tabela 5 – Concentração inibitória mínima (MIC) da vancomicina (VAN), das nanopartículas poliméricas contendo vancomicina (VAN PCL-NP e VAN PLGA-NP) e do branco das nanopartículas (PCL-NP e PLGA-NP) usando cepas clínicas e padrão de S. aureus.

Tratamento

MIC (µg/ml)

Cepas Clínicas ATCC 25923

Cloridrato de VAN 1,0i 1,0i

PCL-NP >128 >128

VAN PCL-NP 1,0i 1,0i

PLGA-NP >128 >128

6.CONCLUSÃO

O presente estudo demonstrou que o emprego do planejamento fatorial fracionado possibilitou a definição e avaliação de diferentes parâmetros para o desenvolvimento de NP carreadoras de vancomicina de forma racional minimizando tempo e custos. Concluímos que o tamanho de partícula aumenta com o acréscimo do volume de polímero e quando o ativo é adicionado ao processo e que a variável razão PCL/VAN, foi a única a apresentar efeito significativo sobre o aumento da concentração de vancomicina encapsulada.

A análise da variância (ANOVA) indicou diferenças significativas (p-valor < 0,05) entre as PLGA-NP e as PCL-NP produzidas conforme ensaio 3. Contudo, deve-se considerar que este resultado pode ter sido influenciado pela não reprodutibilidade da técnica verificada quando a análise estatística foi aplicada aos pontos centrais.

A avaliação dos espectros de IV-TF sugere que a VAN foi nanoencapsulada pelas partículas de PLGA, mas que parte do antimicrobiano pode ter sido adsorvido a superfície da matriz de PCL, o que pode alterar a cinética de liberação da VAN a partir deste nanosistema carreador.

Pode-se observar, através das análises dos termogramas de DSC, que há uma interação física entre PCL e o antimicrobiano, ao contrário do que foi observado com o PLGA. Além disso, ambas NP exibiram VAN na fase amorfa, sugerindo que o fármaco está homogeneamente disperso na matriz polimérica.

As PLGA-NP apresentaram um perfil de liberação in vitro da VAN com um padrão bifásico, isto é, um estágio inicial de liberação de grandes concentrações do ativo, seguido de uma liberação mais controlada, de acordo com os resultados observados no espectro IV-TF e termograma de DSC, que indicaram ausência de interação significativa entre VAN e a matriz polimérica do PLGA.

Através da análise da atividade antimicrobiana in vitro, observamos que não houve mudança nos valores de MIC, mas a atividade da VAN foi mantida, independente das

condições do processo de produção e da encapsulação nas diferentes NP poliméricas contendo VAN.