Desenvolvimento de método cromatográfico para determinação

O desenvolvimento do método cromatográfico iniciou-se avaliando a melhor condição do sinal analítico para bupivacaína e triancinolona. Variação no comprimento de onda entre 263 e 230nm foi realizada para verificar a influência deste parâmetro em relação detecção, seletividade e sensibilidade analítica. Em todas as faixas de comprimento de onda foi possível detectar bupivacaína e triancinolona. O comprimento de onda ideal para bupivacaína seria próximo a 257nm já que esta molécula apresenta cromóforo do “benzeno”, enquanto o melhor sinal da triancinolona seria próximo a 240 nm, pois esta molécula apresenta características cromofóricas de uma “enona”.

As Figuras 4.2, 4.3 e 4.4 mostram que a bupivacaína perde em termos de sensibilidade devido ao deslocamento do comprimento de onda para a região do azul, enquanto triancinolona ganha em termos de sensibilidade com o deslocamento do comprimento de onda. Apesar da baixa sensibilidade para bupivacaína, o desenvolvimento do método cromatográfico com a finalidade de identificação, doseamento e estudo de estabilidade dos fármacos na faixa de micrograma/mililitro não requer sensibilidade extrema, como em casos de determinação de fármacos para ensaios limites de pureza cromatográfica ou em fluidos biológicos.

Todos os cromatogramas apresentaram uma banda mal definida entre 2,5 e 3,5 minutos, correspondente ao sinal de início de análise do material injetado após o tempo morto inicial de circulação pela coluna, particularmente perceptível nas escalas de maior sensibilidade.

O método apresentou seletividade/especificidade adequada, pois apesar das matrizes químico-farmacêutica apresentarem interferentes devido a presença de alguns adjuvantes da formulação, não se observou picos cromatográficos adicionais.

Figura 4.2 - Cromatograma de (1) bupivacaína (200 µg/mL) em acetonitrila:água (60:40, v/v) e comprimento de onda de 263 nm.

A Figura 4.3 mostra o pico cromatográfico da bupivacaína numa proporção de 60% de acetonitrila. Observa-se que a bupivacaína tem um tempo de retenção (4,6 minutos) muito próximo do tempo morto da coluna que é de aproximadamente 2,4 minutos. Essa condição não seria adequada para quantificação da bupivacaína, pois alguns interferentes saem muito próximo deste analito de interesse e o fator de retenção (K´= 0,92) seria menor que 1.

A Figura 4.4 mostra o pico cromatográfico de bupivacaína e triancinolona na mesma proporção de fase móvel, porém redução do comprimento de onda para 257 nm. Observa-se resolução moderada (separação moderada) entre bupivacaína e triancinolona, além de pico não-simétrico para bupivacaína. Desta forma, houve a necessidade de reduzir a proporção de acetonitrila na fase móvel para retardar um pouco mais a eluição dos analitos da coluna cromatográfica, além de encontrar um solvente adequado para melhor a simetria do pico cromatográfico da bupivacaína.

Figura 4.3 - Cromatograma de (1) bupivacaína (100 µg/mL) e (2) triancinolona (200 µg/mL) em acetonitrila:água (60:40, v/v) e comprimento de onda de 257 nm.

Fonte: Autor, 2011

Com a redução em 10% na proporção de acetonitrila, observou-se um melhor tempo de retenção para bupivacaína (5,4 minutos) e triancinolona (6,8 minutos). Porém insuficiente quando se objetiva determinar a concentração dos fármacos em estudos de estabilidade em que a eluição de produtos de degradação pode

acontecer nos mesmos tempo de retenção do segundo analito de interesse (Figura 4.4). A substituição água pelo tampão fosfato equimolar (pH 6,8) na fase móvel promoveu uma melhor simetria do pico cromatográfico da bupivacaína.

Figura 4.4 - Cromatograma de (1) bupivacaína (100 µg/mL) e (2) triancinolona (200 µg/mL) em acetonitrila:tampão fosfato equimolar (0,01M; pH 6,8),(50:50, v/v) e comprimento de onda de 240 nm.

Fonte: Autor, 2011.

Figura 4.5 - Cromatograma de (1) bupivacaína (100 µg/mL) e (2) triancinolona (200 µg/mL) em acetonitrila:tampão fosfato equimolar (0,01M; pH 6,8), (45:55, v/v) e comprimento de onda de 230 nm.

Figura 4.6 - Cromatograma de (1) bupivacaína (100 µg/mL) e (2) triancinolona (200 µg/mL) em acetonitrila:tampão fosfato equimolar (0,01M; pH 6,8), (40:60, v/v) e comprimento de onda de 230 nm.

Fonte: Autor, 2011.

A redução na proporção de acetonitrila para 45% e 40% acompanhou o processo de maior retenção dos analitos de interesse observado na figura 4.4. As figuras 4.5 e 4.6 mostraram que a triancinolona apresenta eluição nos tempos de retenção 8,2 e 11,4 minutos, respectivamente. Nesta última condição, observa-se que o tempo de análise de 13 minutos pode se considerado longo.

Uma última condição analítica foi testada, com a finalidade de reduzir o tempo total de análise (Figura 4.7). Observando a perfeita simetria dos picos cromatográficos de bupivacaína e triancinolona, requisito de qualidade de picos cromatográficos necessário para quantificação, observando a boa separação entre os analitos de interesse e o adequado tempo de análise (11 minutos), estabeleceu- se esta última condição analítica para determinação de bupivacaína e triancinolona.

Figura 4.7 - Cromatograma de (1) bupivacaína (100 µg/mL) e (2) triancinolona (200 µg/mL) em acetonitrila:tampão fosfato equimolar (0,01M; pH 6,8), (47:53, v/v) e comprimento de onda de 230 nm.

Fonte: Autor, 2011.

As condições cromatográficas utilizadas, a partir das amostras comerciais de Neocaína® e Triancil®, foram consideradas viáveis para determinação simultânea de bupivacaína e triancinolona. A última condição analítica foi testada para avaliar se ocorre discriminação entre as concentrações dos analitos através do ensaio de curva de calibração (Figura 4.8 e 4.9), realizada a partir de três injeções de 7 concentrações analisadas incluindo a faixa de concentração das amostras CQ´s, considerando como respectivas concentrações de bupivacaína e triancinolona: 45 µg/mL e 60 µg/mL (CQ1), 90 µg/mL e 120 µg/mL (CQ2) e, 120 µg/mL e 160 µg/mL (CQ3).

Figura 4.8 - Curva de calibração da bupivacaína com método analítico proposto.

Fonte: Autor, 2011.

Figura 4.9 - Curva de calibração da triancinolona com método analítico proposto.

Fonte: Autor, 2011.

O método proposto apresentou linearidade para a faixa de concentração entre 2,00 e 200 µ/mL para bupivacaína e 2,66 e 266 µg/mL, com coeficiente de correlação de r2 = 0,998 e 0,998, respecetivamente. Desta forma, podemos de maior confiança que o método cromatográfico apresenta discriminação entre as faixas de concentração a serem analisadas no estudo de estabilidade acelerado.