Desenvolvimento de métodos cromatográficos em CLAE

A cromatografia a líquido pode ser empregada na análise dos mais variados materiais e da sua natureza vão depender as atividades do analista em efetuar com eficiência, precisão e exatidão a análise cromatográfica. Para se analisar com eficiência a amostra é necessária conhecer o máximo possível as propriedades dos seus componentes como: estrutura química, grupos funcionais, polaridade, solubilidade, concentração, pH e PK dos compostos objeto de análise (CIOLA, 1998).

Durante o processo de desenvolvimento do método algumas considerações devem ser seguidas como: tempo de desenvolvimento do método, o tempo de execução máximo para a análise, o número esperado de amostras por semana, a complexidade da mistura, a estrutura do analito principal (propriedades físico-químicas), possíveis vias de degradação (ex., oxidação, hidrólise, desidratação, fotólise, termólise, racemização) e se o analito ou analitos são ionizáveis (KASAKEVICH, 2007).

Outra consideração importante no desenvolvimento do método é o pré- tratamento da amostra e sua detecção. As amostras que podem potencialmente ser analisadas por CLAE podem ter várias apresentações:

• Amostras prontas para injeção;

• Soluções que requerem diluições, tamponação, adição de um padrão interno, ou outras manipulações volumétricas;

• Sólidos que devem ser primeiro dissolvidos ou extraídos;

• Amostras que requerem um pré-tratamento para removerem interferentes e proteger a coluna ou equipamento de danos.

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Obviamente que a injeção direta da amostra é preferível pela conveniência e uma melhor precisão, no entanto, muitas amostras para serem analisadas em CLAE precisam ser pesadas e diluídas antes da injeção. Os melhores resultados são obtidos quando o solvente utilizado para solubilizar a amostra é a própria fase móvel, já que este procedimento diminui ruídos na linha de base e outros problemas, como a assimetria da banda cromatográfica. Algumas amostras necessitam de um pré-tratamento para remover seus interferentes antes de serem injetadas no CLAE. Isto significa que é muito importante conhecer a natureza da matriz da amostra e as concentrações dos vários analitos. Em muitos casos o desenvolvimento de um método adequado para o pré- tratamento da amostra pode ser mais complicado do que obter uma boa separação (SNYDER et al., 1997).

Antes da primeira amostra ser injetada durante o desenvolvimento do método, é necessário ter a certeza de que o detector selecionado irá ser sensível a todos os componentes de interesse da amostra. Detectores de UV com comprimentos de onda variável normalmente são a primeira escolha, por causa da sua conveniência e aplicabilidade para várias amostras. Por esta razão, informações sobre o espectro de UV pode ser uma importante ajuda para o desenvolvimento do método. Espectros de UV podem ser encontrados na literatura, estimados pela estrutura química dos componentes da amostra de interesse, medidos diretamente (se a substância pura estiver disponível), ou obtidos durante a separação em CLAE por meio do detector de arranjo de fotodiodos (PDA). Quando a resposta do UV da amostra estiver inadequada, outros detectores são disponíveis (fluorescência, eletroquímico, etc.), ou a amostra pode ser derivatizada para melhorar a detecção (SNYDER et al., 1997).

A estratégia recomendada para escolher as condições iniciais na primeira separação é classificar a amostra em comum ou especial. São consideradas amostras comuns misturas de moléculas pequenas (<2000 Da) que podem ser separadas usando condições iniciais mais ou menos padronizadas. Amostras especiais necessitam de colunas e condições diferenciadas para separarem-se. Amostras comuns podem ser classificadas como neutras ou iônicas. Amostras iônicas formam compostos ácidos, básicos, anfóteros e sais orgânicos. Se a amostra é neutra, normalmente não é necessário usar fases móveis tamponadas ou adicionadas de aditivos, como reagente par iônico ou aminas. Amostras ácidas ou básicas comumente requerem a adição de tampão na fase móvel. Para amostras básicas, colunas de fase reversa são recomendadas e a adição de aminas na fase móvel pode ser benéfica (COLLINS et al, 2006).

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Uma das bases da corrida exploratória inicial é o tipo de eluição que pode ser isocrática ou através de eluição por gradiente, disponível em muitos sitemas de CLAE. Neste ponto também pode ser aparente que condições típicas de fase reversa podem causar retenção insuficiente da amostra, sugerindo o uso de cromatografia por pareamento iônico ou cromatografia de fase normal. Alternativamente, a amostra pode estar retida fortemente com 100% de acetonitrila na fase móvel, sugerindo o uso de cromatografia de fase reversa não aquosa (NARP) ou com fase normal. Uma alternativa para a separação inicial isocrática é o uso de eluição em modo gradiente. Há várias vantagens para o uso inicial de um gradiente, como a possibilidade de determinar se a eluição isocrática ou por gradiente é a melhor escolha, e estimar a melhor força do solvente para a próxima tentativa (isocrática) de separação. Uma separação inicial por gradiente é também vantajosa para o desenvolvimento do método desde que mostre a melhor resolução da amostra que irá ser obtida por separação isocrática com um solvente forte (SNYDER et al., 1997).

Separação ou resolução é o requerimento primário em análises quantitativas por CLAE. Geralmente, para amostras que contém cinco ou menos componentes, a resolução da linha de base (Rs > 1,5) pode ser facilmente obtida para os picos de interesse. Este nível de resolução favorece um máximo de precisão nos resultados. A resolução diminui durante o tempo de vida da coluna e pode variar de dia para dia com pequenas flutuações nas condições de separação. No entanto, valores de Rs = 2 ou maiores deverá ser a meta para o desenvolvimento do método para misturas simples. Tal resolução irá favorecer tanto os ensaios de precisão, quanto de robustez do método. Amostras que contém dez ou mais componentes irão dificultar a separação, e aqui a meta da separação deverá ser relaxada para Rs > 1,0 a 1,5 (SNYDER et al., 1997).

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