Desenvolvimento de protocolos, utilizando qPCR, para diagnóstico de

A técnica de PCR em tempo real vem crescentemente sendo explorada para a detecção de fitonematoides por ser rápida e mais sensível que os métodos tradicionalmente empregados (tais como identificação morfológica, PCR-RFLP e PCR convencional). Além do uso na detecção, ensaios de quantificação molecular já foram propostos para algumas espécies economicamente importantes como: Pratylenchus

thornei (Yan et al., 2012), Globodera pallida e G. rostochiensis (Nakhla et al., 2010) e Xiphinema index (Ghelder et al., 2014). Contudo, ensaios para detecção e mesmo

quantificação molecular de espécies de Aphelenchoides são escassos. Ibrahim et al. (1994) conseguiram diferenciar várias espécies de Aphelenchoides usando ITS-PCR- RFLP, mas não tiveram sucesso na identificação de populações de A. besseyi. McCuiston et al. (2007) desenvolveram um método sensível e rápido para detecção de

A. fragariae com extração de DNA diretamente do tecido foliar usando primers

específicos em ensaio de PCR. Os autores demonstraram a acurácia e confiabilidade do protocolo por meio de testes em amostras de tecido naturalmente infectado de mais de 120 plantas ornamentais hospedeiras de A. fragariae.

Em geral, é mais frequente o uso de regiões não transcrita do DNA ribossomal (ITS1 ou ITS2) por abrigarem maior variabilidade. No entanto em virtude da extensiva variação intraindividual observada em algumas espécies de fitonematoides (Hugall et

al. 1999), outros marcadores moleculares têm sido explorados para a detecção. Por

exemplo, Rybarczyk-Mydlowska et al. (2012) mostraram que a região codificadora SSU do rDNA abrigou nucleotídeos informativos o suficiente para o desenho de primers específico para detecção de quatro espécies economicamente importantes de

Aphelenchoides spp. (A. besseyi, A. fragariae, A. ritzemabosi e A. subtenuis) em

ensaios de qPCR, mas testes em diferentes populações das espécies alvo não foram realizados para a confirmação da especificidade dos ensaios.

Os protocolos de qPCR desenvolvidos no presente estudo podem ser utilizados para identificação e quantificação de nematoides na amostra, além de proporcionarem novas possibilidades para analisar um grande número de amostras, principalmente no serviço de certificação fitossanitária, através da automatização da extração e procedimentos moleculares que aumentam a velocidade e precisão dos resultados (Reid et al., 2010). Por exemplo, o uso dos conjuntos de primers/sonda propostos aqui para detecção de A. besseyi e A. fujianensis nas condições testadas reduziram o

65

tempo gasto para detecção, uma vez que 96 amostras foram processadas e analisadas simultaneamente num período de apenas 30 minutos.

Os protocolos desenvolvidos foram sensíveis ao detectar o DNA alvo extraído a partir de um único nematoide e específicos quando desafiados contra espécies relacionadas e frequentemente associadas a sementes de forrageiras (A. fragariae, A.

ritzemabosi e Aphelenchoides sp.). Cabe ressaltar que, A. bicaudatus, A. sexlineatus

(Favoreto et al., 2011) e A. subtenuis (Sharma et al., 2001) também podem ocorrer em associação a sementes de forrageiras, mas, por indisponibilidade de material, não foram incluídas no presente estudo. No entanto, experimentos futuros devem ser conduzidos para verificar a especificidade dos primers e sondas a essas espécies. Ainda, houve reação cruzada quando o conjunto de primers/sonda para detecção de

A. besseyi foi desafiado contra altas concentrações de DNA plasmidial de A. fujianensis (Figura 4B). Contudo, nenhum sinal de amplificação foi observado quando

o conjunto primers/sonda para A. besseyi foram desafiados contra séries quantitativas de 1, 3, 6 e 10 espécimes de A. fujianensis, mas testes adicionais precisam ser realizados. Em adição, nos testes realizados na presença de somente um espécime de A. fujianensis foi verificado sinal de amplificação com valores de Cq próximo a 34, mas uma diferença de 10 ciclos foi observada entre a detecção do DNA alvo (amostras de A. besseyi) e o não alvo (amostras de A. fujianensis) (Tabela 3). Deste modo, a possibilidade de falso-positivo em amostras testadas para A. besseyi e que tenham alta densidade populacional de A. fujianensis precisa ser melhor investigada.

Teoricamente, o uso de sondas hidrolíticas (Taqman) deveria garantir a ausência de sinal fluorescente na ausência do DNA alvo. A possibilidade de amplificação não específica em ensaios com sonda Taqman já foi relado. Os efeitos de sequências divergentes em dois e cinco nucleotídeos presentes no sítio de anelamento de sonda Taqman foram avaliados por Yao et al. (2006) usando diferentes DNA plasmidiais. A alteração em dois nucleotídeos no sítio da sonda resultou na redução da eficiência, mas a sensibilidade foi mantida. Mesmo com cinco nucleotídeos divergentes no sítio de anelamento o sinal de amplificação foi detectado, mas com substancial redução na eficiência (de 99 para 81%) e na sensibilidade (de 10 para 100 cópias). Entretanto, nenhum sinal foi detectado quando a posição de um dos cinco nucleotídeos divergentes foi alterada.

Houve considerável variação na estimativa do número de cópias presente em um único nematoide em ambas as espécies. Esta extensiva variação pode estar associada a não homogeneização apropriada das amostras de DNA durante a montagem das reações. Apesar de sempre as amostras terem sido ressuspendidas

66

por agitação em vortex, seguido por rápida centrifugação, a presença de microesferas de vidro no extrato final de DNA, pode ter limitado a homogeneização das mesmas. Outra fonte de variação pode ter sido a eficiência do método de extração de DNA utilizado, associado ao uso de uma técnica tão sensível como qPCR.

Mesmo considerando essas fontes de variação mencionadas acima, o número médio de cópias estimado em amostras de A. besseyi foi quase duas vezes maior que o observado em A. fujianensis. Esta variação pode estar associada à seleção ao acaso de fêmeas com a espermateca cheia de espermatozoides, que foi frequentemente observado nas populações de A. besseyi ao contrário de A.

fujianensis. Isto indica que o estádio de vida do nematoide pode influenciar na

quantificação do DNA presente na amostra. A influência do estádio de desenvolvimento do nematoide no sinal de fluorescência também foi relatado por Ghelder et al. (2014), em que o os valores de Cq foram ligeiramente menores em amostra com juvenis do que com adultos de Xiphinema index com igual número de nematoides. Entretanto, Yan et al. (2013) não observaram nenhuma diferença significativa entre os valores de Cq entre juvenis, fêmea e ovo de Pratylenchus neglectus, sugerindo que a quantidade de DNA seja semelhante nos diferentes

estádios de desenvolvimento desse nematoide. Apesar da variação no número de cópias da molécula alvo estimado nos ensaios de qPCR, estes foram superiores ao limite de detecção como visto nos testes usando as diluições seriais (Figuras 2A e 3A).

O aumento na precisão da quantificação do DNA alvo presente nas amostras permitirá a determinação de valores de corte (cut-point) mais acurados, determinados por análise discriminante e árvores de classificação, por exemplo. Isso poderá ser alcançado pela eliminação da interferência das microesferas de vidros na homogeneização das amostras (pela transferência do extrato de DNA para novos microtubos logo após o processo de extração), ou mesmo testando-se outros métodos de extração.

5.2. Variabilidade intraindividual entre as sequências da região LSU do rDNA em