3.4.1 Imunoensaio para determinação de LDL(-)
Na padronização do ELISA para LDL(-) (Figura 9), placas de poliestireno de 96 poços, fundo plano (high binding, Corning/Costar®, nº cat. 3590), foram sensibilizadas com 50 µL/poço de MAb 1A3H2 nas concentrações 5, 10 ou 15 µg/mL diluído em tampão carbonato bicarbonato 0,05 M pH 9,6 e incubadas overnight a 4ºC para adsorção do anticorpo na superfície da placa. Após a incubação, as placas foram lavadas 3 vezes com tampão PBS-Tween 0,05% pH 7,4, 200 µL/poço. Em seguida, para avaliar o bloqueio, foram adicionados 150 µL/poço de caseína 1 ou 2 % (Sigma-Aldrich®), albumina 1 ou 2% (Sigma-Aldrich®) ou leite desnatado 2 ou 5% (Molico, Nestlé®) em tampão PBS-Tween 0,01%, permanecendo por 1h30min em estufa 37°C. Após esse período, as placas foram lav adas como descrito anteriormente. Foram acrescentados 50 µL/poço de LDL(-) purificada como padrão do imunoensaio em diferentes concentrações e 50 µL/poço de amostras de plasma em diferentes diluições em 1% de leite desnatado em tampão PBS-Tween 0,01%. As placas ficaram incubadas por 1h30min em estufa 37°C. Como controle negativo foi utilizada a LDL(n). As placas foram lavadas e então colocados 50 µL/poço de MAb 2C7D5F10 biotinilado nas concentrações 5, 10 ou 15 µg/mL diluído em 1% de leite desnatado em tampão PBS-Tween 0,01%, sendo incubadas por 1hem estufa 37°C. As placas foram lavadas e foram adicionados 50 µL/poço de Streptavidina conjugada à peroxidase (Biosource, Invitrogen®) diluída 1:200.000, 1:100.000, 1:80.000 ou 1:50.000 em 1% de leite desnatado em tampão PBS-Tween 0,01% e incubadas por 1h em estufa 37°C. Após esta etapa, as placas foram lavadas 4 vezes, sendo que na última lavagem as placas ficaram 30 segundos de molho. A revelação do ensaio foi testada com 50 µL/poço de OPD (Sigma-Aldrich®) diluído em tampão citrato-fosfato, pH 5,3 na concentração final de 1 mg/mL, com 1 µL de H2O2 por mL de tampão ou 50 µL/poço de TMB (Sigma-Aldrich®). Após o desenvolvimento da cor por 15 minutos em estufa 37°C, a reação com OPD foi interrompida com 50 µL/poço de ácido sulfúrico 2 M e leitura efetuada em leitora de placas (SpetraCountTM, Packard) a 492 nm; a reação com TMB foi interrompida com 50 µL/poço de ácido sulfúrico 0,5 M e lida a 450 nm.
Figura 9. Representação esquemática do ELISA para LDL(-). Placas foram sensibilizadas com MAb 1A3H2 (1), o qual capturou a LDL(-) da amostra (2). O MAb 2C7D5F10 conjugado a biotina (3) se ligou à LDL(-) capturada nos poços. Então, foi adicionada a streptavidina conjugada à peroxidase (4), que se ligou à biotina. TMB e OPD foram testados como cromógenos.
3.4.2 Imunoensaio para determinação de anticorpos anti-LDL(-)
Na padronização do imunoensaio para anticorpos anti-LDL(-) (Figura 10) placas de poliestireno de 96 poços, fundo plano (high binding, Corning/Costar®, nº cat. 3590) foram sensibilizadas com 1 µg/mL ou 5 µg/mL de LDL(-) (50 µL/poço) diluída em tampão carbonato bicarbonato 0,05 M pH 9,6 e incubadas overnight a 4ºC para adsorção da mesma na superfície da placa. Como controle negativo, foi utilizada a LDL(n) na sensibilização das placas. Após a incubação, as placas foram lavadas 3 vezes com tampão PBS-Tween 0,05% pH 7,4, 200 µL/poço. Em seguida, para bloquear os sítios remanescentes da placa, foram adicionados 150 µL/poço de leite desnatado a 2% (Molico, Nestlé®) em tampão PBS-Tween 0,01%, permanecendo por 1h30min em estufa 37°C. Após esse período, as placas foram lavadas como descrito anteriormente. Foram acrescentados 50 µL/poço MAb 2C7D5F10 em diferentes concentrações como padrão dos imunoensaios e 50 µL/poço de amostras de plasma em diferentes diluições em 1% de leite desnatado em tampão PBS-Tween 0,01% e incubou-se a placa por 1h30min em estufa 37°C. As placas foram lavadas e então, colocados 50 µL/poço de anti-IgG humana conjugado a peroxidase (Bio-Rad®), diluído 1:5000, 1:2500 ou 1:1250 em 1% de leite desnatado em tampão PBS-Tween 0,01% nos poços das amostras de plasma, e anti-IgG de camundongo conjugado a peroxidase (Invitrogen-Zimed®) diluído 1:4000, 1:2000, 1:1000 ou 1:500 em 1% de leite desnatado em tampão PBS-Tween 0,01%
nos poços da curva padrão, sendo incubadas por 1h em estufa 37°C. Após esta etapa, as placas foram lavadas 4 vezes e na última lavagem as placas ficaram 30 segundos de molho. A revelação das placas foi realizada com 50 µL/poço de TMB (Sigma-Aldrich®). Após 15 minutos em estufa 37°C, a reação foi parada com 50 µL/poço de ácido sulfúrico 0,5 M e a absorbância das placas foram medidas a 450 nm em uma leitora de espectrofotometria (SLT Spectra).
Figura 10. Representação esquemática do ELISA para anti-LDL(-). Placas foram sensibilizadas com LDL(-) (1), a qual capturou anti-LDL(-) da amostra (2). Então, foi adicionado anticorpo anti-IgG humana conjugado a peroxidase (3). TMB foi usado como cromógeno.
3.4.3 Imunoensaio para determinação de imunocomplexos de LDL(-)
Na padronização do imunoensaio para IC-LDL(-) (Figura 11), placas de poliestireno de 96 poços, fundo plano (high binding, Corning/Costar®, nº cat. 3590), foram sensibilizadas com 2,5, 5 e 10 µg/mL/poço da porção Fab do MAb 2C7D5F10 diluídas em tampão carbonato bicarbonato 0,05 M pH 9,6 e foram incubadas
overnight a 4ºC para adsorção do mesmo na superfície da placa. Após a incubação,
as placas foram lavadas 5 vezes com tampão PBS-Tween 0,05% pH 7,4, 200 µL/poço, com 30 segundos de molho na última lavagem. Em seguida, para bloquear os sítios remanescentes da placa foram adicionados 150 µL/poço de caseína 2,5% (Sigma-Aldrich®), albumina bovina 3% (Sigma-Aldrich®) ou leite desnatado 2% ou 5% (Molico, Nestlé®) em tampão PBS-Tween 0,01%, permanecendo por 1h30min em estufa 37°C. Após esse período, as placas foram lavadas como descrito anteriormente. Foram acrescentados 50 µL/poço do pool de plasma com concentração conhecida de IgG ou 50 µL/poço das amostras de plasma em
diferentes diluições em 1% de leite desnatado em tampão PBS-Tween 0,01% e incubou-se a placa por 1h30min em estufa 37°C. As placas foram lavadas e então colocados 50 µL/poço de anticorpos anti-IgG humana (H+L) ou anticorpos anti-IgG humana Fc específico nas diluições 1:2000, 1:4000 e 1:8000 conjugados a peroxidase (Sigma-Aldrich®) em 1% de leite desnatado em tampão PBS-Tween 0,01%, sendo incubadas por 1hem estufa 37°C. Após esta etapa, as placas foram lavadas e a revelação dos ensaios foi feita com 50 µL/poço de TMB. Após 15 minutos em estufa 37°C, a reação foi interrompida com ácido sulfúrico 0,5 M e as placas foram lidas a 450 nm em uma leitora de espectrofotometria (SLT Spectra).
Figura 11. Representação esquemática do ELISA para IC-LDL(-). Placas foram sensibilizadas com o Fab do MAb 2C7D5F10 (1), o qual capturou IC-LDL(-) da amostra (2). Então, foram testados os anticorpo anti-IgG e anti-Fc de IgG humana conjugados à peroxidase (3). TMB foi usado como cromógeno.