Desenvolvimento e validação do método analítico para quantificação

No intuito de garantir que um método analítico forneça informações confiáveis sobre a amostra, ele deve ser validado, inclusive essa exigência se estende para o registro de novos produtos, tanto em nível de Brasil como em outros países.

A validação, nesse trabalho, foi realizada seguindo a RE Nº 899, de 29 de maio de 2003 da Agência Nacional de Vigilância Sanitária (ANVISA), com o objetivo de demonstrar que o método é apropriado para a determinação quantitativa do 1,4- naftoquinona e garantir, através de estudos experimentais, que o método atenda às exigências e a confiabilidade dos resultados. Para que esses resultados sejam alcançados, o método deve apresentar seletividade, especificidade, linearidade, intervalo, exatidão, precisão, robustez, limite de detecção e de quantificação, adequados à análise (BRASIL, 2003).

Para a realização da validação foi utilizada as dependências do Laboratório NANOPOL, localizado na UFCG. O método foi desenvolvido para espectroscopia na região do ultravioleta (UV/VIS) devido a sua utilização ser de baixo custo e de vasta aplicação na rotina laboratorial e simples instrumentação comparada à técnica de cromatografia (NUNES et al., 2015). A absorbância das amostras foi medida no comprimento de onda de máxima absorção em 341 nm, utilizando o espectrofotômetro de UV/Vis da Perkin-Elmer, modelo Lambda 35, empregando-se uma cubeta de quartzo de caminho óptico de 10 mm, volume de 3,5 mL.

Inicialmente, a solução padrão foi obtida pesando 0,0071 g de 1,4- naftoquinona, que foi transferida para balão volumétrico de 100 mL com solução salina tampão fosfato (PBS) e, posteriormente, colocada em um sonificador durante 2 horas com temperatura constante de 40o_{C visando uma dissolução mais eficiente da}

substância nesse meio. Diluições com diferentes concentrações foram realizadas utilizando PBS a partir da solução padrão.

Os parâmetros de seletividade e especificidade foram verificados a partir da leitura em UV/VIS do 1,4-naftoquinona em vários solventes, comparando o comprimento de onda em cada amostra, com o objetivo de averiguar se os comprimentos de onda presentes não interfeririam naquele identificado na droga.

Em relação à linearidade e intervalo, a primeira foi determinada a partir da construção de três curvas de calibração usando cinco pontos com valores de concentração do 1,4-naftoquinona situados no intervalo de 50 a 450 µMol/L. A linearidade foi analisada por regressão linear calculada pelo método dos mínimos quadrados.

A exatidão foi observada avaliando-se três níveis de concentração do 1,4- naftoquinona (50, 250 e 450 µMol/L) em triplicata, totalizando nove quantificações. O coeficiente de variação e a porcentagem de recuperação foram utilizados para avaliar a exatidão definida na Equação 1:

Exatidão (%) = CEO x 100 Equação 1

CT

Onde: CEO = Concentração experimental obtida CT = Concentração teórica

A precisão do método analítico foi avaliada em três níveis, na concentração média: repetibilidade (precisão intracorrida), precisão intermediária (precisão intercorrida) e reprodutibilidade. A repetibilidade foi verificada através da análise de seis soluções na concentração de 250 µMol/L. A precisão intermediária foi determinada pela análise de seis medidas de soluções na mesma concentração, realizadas em dois dias distintos e por operadores distintos. A reprodutibilidade (precisão interlaboratorial) foi realizada por meio da análise de seis soluções a uma concentração de 250 µMol/L, em um outro laboratório com equipamento diferente.

A robustez do método foi avaliada em sextuplicata pela variação do solvente nas amostras na concentração média (250 µMol/L), utilizando-se água destilada. A avaliação foi realizada pela análise dos coeficientes de variação entre as médias obtidas. Outro fator experimental envolvido na robustez foi a fotoestabilidade do 1,4- naftoquinona durante o período de análise. Foi observado que, em outro composto muito semelhante à 1,4-naftoquinona, haveria a possibilidade de sensibilidade à luz (CUNHA-FILHO et al., 2009). Para tanto, seis amostras da solução de 1,4- naftoquinona, à concentração de 450 µMol/L foram expostas à iluminação artificial durante 15 dias e comparadas diariamente através da leitura de sua absorbância em UV-VIS com outras seis protegidas da luz.

Os limites de detecção (LD) e quantificação (LQ) foram determinados, matematicamente, a partir da curva analítica resultante da média das três curvas analíticas. O cálculo para determinação dos valores correspondentes ao LD e LQ, fundamenta-se no desvio padrão do residual da linha de regressão e sua relação com a inclinação da reta (coeficiente angular) na curva analítica, seguindo as Equações 2 e 3:

LD = DP x 3 Equação 2

I

Onde: DP = Desvio padrão do intercepto com relação ao eixo dos Y; I = Inclinação da curva analítica

LQ = DP x 10 Equação 3

I

Onde: DP = Desvio padrão do intercepto com relação ao eixo dos Y; I = Inclinação da curva analítica

A concentração de 1,4-naftoquinona liberada nas membranas de quitosana de ambas metodologias, as neutralizadas e as que tiveram variações nas concentrações do agente reticulante, em solução tampão fosfato (PBS) foi analisada em espectrofotômetro UV-Vis da Perkim Elmer modelo Lambda 35, no Laboratório Nanopol. Cada tipo de membrana foi imersa em 25 mL de PBS, utilizada como meio de diluição e mantida em contínua agitação (50 rpm), a temperatura de 37ºC em uma incubadora Shake modelo IKA-KS4000i.

Para avaliar o percentual do 1,4-naftoquinona liberado nas membranas, uma alíquota de, aproximadamente, 3 mL do sistema era retirada para leitura após decorridos os intervalos de tempos pré-determinados, os quais totalizaram uma análise com duração de 360 horas. Após a retirada de cada alíquota para ser quantificada, a mesma era reposta a sua solução de origem. O ensaio foi realizado em triplicata e, anteriormente à decisão de colocar as membranas imersas em 25 mL, foi averiguado em procedimento experimental o comportamento de liberação do 1,4- naftoquinona da membrana QN7T05L em 50 mL, como também em 25 mL de PBS. Decorridos 15 dias, verificou-se que havia um melhor perfil de liberação da membrana em solução de PBS referente à 25 mL, com concentração superior, justificando-se sua escolha para liberação da substância das demais membranas.