DESENVOLVIMENTO E VALIDAÇÃO DE METODOLOGIA ANALÍTICA DE CROMATOGRAFIA LÍQUIDA DE ALTA

EFICIÊNCIA PARA DETERMINAÇÃO DO TEOR DE ASTAXANTINA LIVRE

A cromatografia líquida é a técnica mais precisa para separar e quantificar carotenoides em extratos naturais, inclusive em concentrações extremamente baixas. O método mais comumente utilizado para análises de carotenoides é a cromatografia líquida de alta eficiência (CLAE) empregando a detecção por UV/Vis, visto que esse método apresenta uma alta sensibilidade e proporciona uma separação adequada em curtos intervalos de tempo (FELTL et al., 2005).

A fração carotenoide da microalga Haematococcus pluvialis é constituída principalmente de astaxantina na forma esterificada.

Entretanto, uma quantificação precisa por cromatografia líquida dos ésteres de astaxantina é ainda um desafio, devido à diversidade de ácidos graxos passíveis de se ligarem às hidroxilas terminais da molécula. Ainda, a eluição em diferentes tempos de retenção dos ésteres, assim como a ausência de padrões comerciais para calibração, dificulta o processo de quantificação (YUAN, 1999).

Em contraste, vários métodos foram desenvolvidos e validados para determinação da astaxantina livre (SARADA; TRIPATHI; RAVISHANKAR, 2002; HIGUERA-CIAPARA et al., 2003; RAO et al., 2009; ANARJAN et al., 2012). Nesse trabalho, uma metodologia analítica foi desenvolvida e validada partindo de condições previamente descritas na literatura, utilizando um cromatógrafo de alta eficiência acoplado a um detector de arranjo de fotodiodos (DAD). Diferentes proporções da solução de ácido fórmico 0,1% e de metanol, assim como diferentes tempos de corrida e temperaturas do forno da coluna foram testadas durante o desenvolvimento do método.

Em sistemas de CLAE de fase reversa, os carotenoides não esterificados eluem primeiro, seguido sequencialmente pelos monoésteres menos polares, β-caroteno e, por último, os diésteres apolares. Na Figura 11 é apresentado o cromatograma representativo obtido nas condições de análise otimizadas para determinação do teor de astaxantina livre na solução extrativa de H. pluvialis. Neste caso, a astaxantina livre exibiu um tempo de retenção de aproximadamente 9,9 min com tempo de análise de 22 min.

Figura 11. Cromatograma obtido na análise da solução extrativa de Haematococcus pluvialis por cromatografia líquida de alta eficiência com

detecção no comprimento de onda de 480 nm. (1) Astaxantina livre.

0.0 2.5 5.0 7.5 10.0 12.5 15.0 17.5 20.0 min 0 25 50 75 100 125 150 175 200 225 250 275 mAU AD1:475nm (1)

4.2.1 Linearidade

A linearidade é a capacidade de um método de obter resultados diretamente proporcionais à concentração do analito de interesse em um determinado intervalo de concentração (SHABIR, 2003). O método desenvolvido para a determinação da astaxantina livre mostrou ser linear na faixa de concentração entre 0,05 e 4,0 µg/mL, com um coeficiente de determinação (r²) de 0,999 e equação de reta correspondendo a y = 235421x – 3419,2, onde x representa a concentração de astaxantina livre em µg/mL e y a área absoluta do pico (Figura 12).

Figura 12. Curva de calibração da astaxantina padrão obtida por cromatografia

líquida de alta eficiência.

0 1 2 3 4 5 0.0 200000.0 400000.0 600000.0 800000.0 1000000.0 Conc. de astaxantina (µg/mL) m A U

4.2.2 Limites de detecção e quantificação

O limite de detecção (LD) é definido como a menor quantidade do fármaco que pode ser detectada em uma amostra, porém, não necessariamente quantificada como um valor exato. O limite de quantificação (LQ) é definido como sendo a menor quantidade do fármaco em uma amostra capaz de ser quantitativamente determinada com precisão e exatidão (ICH, 2005). Os valores de LD e LQ foram determinados a partir da triplicata das curvas de calibração, e corresponderam a 0,013 e 0,039 μg/mL, respectivamente.

4.2.3 Precisão

A precisão de um método bioanalítico é a medida dos erros aleatórios e representa a proximidade dos resultados obtidos, a partir de

medidas independentes de amostragens múltiplas de uma amostra homogênea.Este é um importante parâmetro que possibilita decidir se o método é confiável ou não para o objetivo da análise (CASSIANO et al., 2009).

Os resultados obtidos na avaliação da repetibilidade e precisão intermediária do método cromatográfico para determinação da astaxantina livre estão mostrados nas Tabelas 6 e 7, respectivamente. Os valores de desvio padrão relativo (DPR) para todas as análises encontraram-se abaixo de 5%, demonstrando uma variabilidade entre as amostras intra e interdia aceitável.

Tabela 6. Resultados obtidos na análise da repetibilidade do método

desenvolvido por CLAE para quantificação da astaxantina livre na solução extrativa de H. pluvialis.

Repetições Concentração _{(μg/mL) (μg/mL)} Média DPR (%)

1 1,43 2 1,42 3 1,36 1,40 1,95 4 1,38 5 1,42 6 1,41

Tabela 7. Resultados obtidos na análise da precisão intermediária do método

desenvolvido por CLAE para quantificação da astaxantina livre na solução extrativa de H. pluvialis.

Dias Concentração _{(μg/mL) (μg/mL)} Média DPR (%)

1 1,40

2 1,43 1,43 2,10

3 1,46

4.2.4 Exatidão

A exatidão é um parâmetro que representa o grau de concordância entre o valor obtido pelo método analítico e o valor nominal, aceito como referência (ICH, 2005). Neste estudo a exatidão do método foi determinada a partir do ensaio de adição de padrão, que consiste na adição de quantidades conhecidas da substância de referência na matriz da amostra, neste caso a solução extrativa de H. pluvialis (RIBANI et al., 2004). Segundo a legislação brasileira, a exatidão pode ser calculada como porcentagem de recuperação da

quantidade de substância referência adicionada à matriz (BRASIL, 2003).

Conforme mostrado na Tabela 8, os valores de recuperação da astaxantina livre na solução extrativa variaram de 98,29 a 101,13%, evidenciando a exatidão do método.

Tabela 8. Recuperação da astaxantina livre após adição de solução padrão em

amostras de solução extrativa de H. pluvialis.

Concentração de astaxantina livre (μg/mL) Recuperação (%) DPR* (%) Extrato nominal Sol. Padrão adicionada Extrato + Sol. Padrão (Cteor.) Extrato + Sol. Padrão (Cexp.) 1,38 0,14 1,52 1,51 99,34 0,66 0,39 1,77 1,79 101,13 0,67 1,54 2,92 2,87 98,29 0,35

*DPR: desvio padrão relativo. 4.2.5 Robustez

A robustez de um método analítico mede sua suscetibilidade frente às pequenas variações que podem ocorrer durante as análises de rotina (CASSIANO et al., 2009). Para avaliar a robustez do método desenvolvido, os parâmetros comprimento de onda de detecção e temperatura de forno foram modificados, com posterior análise do teor e do tempo de retenção da astaxantina livre. Os resultados estão mostrados na Tabela 9.

Como se pode notar, as pequenas variações realizadas no método não levaram a uma mudança no teor de astaxantina livre. Ao variar a temperatura do forno 2,0 ºC acima ou abaixo em relação à temperatura utilizada rotineiramente, é possível verificar uma leve mudança no tempo de retenção da astaxantina, possivelmente pela alteração de viscosidade dos solventes ao passar pela coluna. Entretanto, essa alteração não influenciou no teor de astaxantina obtido, confirmando a robustez do método desenvolvido.

Tabela 9. Parâmetros cromatográficos avaliados na robustez do método

desenvolvido por CLAE para quantificação da astaxantina livre na solução extrativa de H. pluvialis.

Parâmetros Teor (μg/mL) DPR (%) Tempo de

Retenção (min.) Comp. de onda (nm) 473 1,20 2,66 9,94 475 1,21 1,57 9,95 477 1,21 1,32 9,95 Temperatura (ºC) 27 1,23 1,30 10,13 29 1,21 1,57 9,95 31 1,22 1,88 9,75

4.3 DETERMINAÇÃO DO TEOR DE ASTAXANTINA TOTAL NA