Desenvolvimento e validação de método bioanalítico quiral para quantificação dos enantiômeros (R)-metoprolol e

(S)-metoprolol em plasma humano

O método analítico enantioseletivo por cromatografia líquida para quantificação dos enantiômeros do metoprolol foi desenvolvido empregando-se coluna cromatográfica quiral.

Para que a separação quiral aconteça é necessário a formação de diastereoisômeros na superfície da coluna, pois esses estereoisômeros possuem propriedades físico-químicas diferentes. O composto que formar o diastereoisômero mais estável terá um tempo de eluição maior, enquanto aquele menos estável será eluído primeiro. As forças que regem essa interação são fracas e requerem uma otimização cuidadosa por ajuste da fase móvel e de temperatura, a fim de maximizar a seletividade do método.

O efeito da temperatura é importante na separação quiral: baixas temperaturas aumentam o reconhecimento quiral, mas com a desvantagem de que elas podem alterar a cinética da transferência de massa, e também prejudicar a separação por causar alargamento dos picos.

Estão descritos na literatura alguns métodos quirais para a quantificação dos enantiômeros do metoprolol em plasma, por meio de cromatografia liquida de alta eficiência (CLAE) com detecção de fluorescência. Os principais utilizam a coluna quiral do tipo Chiralcel OD® _{derivada de carbamato de celulose tris-} 3,5-dimetilfenil, com fase móvel constituída de hexano, etanol e dietilamina, variando suas proporções.

Para o desenvolvimento do metódo foi avaliado o efeito de diferentes fatores, tais como proporção dos solventes orgânicos, pH e fluxo da fase móvel, e temperatura do forno. Todas as condições foram testadas utilizando detecção por fluorescência nos comprimentos de onda de 230 (excitação) e 305 nm (emissão) para o metoprolol. Para as análises foram utilizadas soluções preparadas em água:metanol (90:10), na concentração de 250 ng.mL-1 para cada enantiômero do metoprolol.

A partir dos resultados observados o método enantioseletivo foi desenvolvido e validado para quantificação dos enantiômeros do metoprolol em

plasma por cromatografia líquida de alta eficiência com detecção por fluorescência, após extração por precipitação de proteínas utilizando acetonitrila, e ofloxacino como padrão interno (PI).

4.2.2.1 Preparo das soluções estoque padrão e soluções de

trabalho padrão dos enantiômeros (R)-metoprolol e (S)-

metoprolol

Prepararam-se soluções estoque padrão dos enantiômeros do metoprolol na concentração de 100 µg.mL-1 em água:metanol (10:90, v/v), cada um. Estas soluções foram acondicionadas em frascos de vidro âmbar e armazenadas em freezer à temperatura de -20ºC.

As soluções de trabalho padrão de (R)-metoprolol e (S)-metoprolol foram preparadas a partir das respectivas soluções estoque padrão, transferindo-se alíquotas adequadas para balões volumétricos e completando-se o volume com água:metanol (90:10, v/v), conforme descrito no Quadro 6. As soluções de trabalho foram acondicionadas em frascos de vidro âmbar e armazenadas em geladeira à temperatura de 4ºC.

Quadro 6: Preparo das soluções de trabalho padrão de (R)-metoprolol e S

metoprolol. Solução de trabalho padrão Concentração da solução estoque padrão Volume de solução estoque padrão

Volume final Concentração final CS1 100 µg.mL-1 50 µL 100 mL 50 ng.mL-1 CS2 100 µg.mL-1 _{50 µL 50 mL 100 ng.mL}-1 CS3 100 µg.mL-1 _{50 µL 25 mL 200 ng.mL}-1 CS4 100 µg.mL-1 125 µL 25 mL 500 ng.mL-1 CS5 100 µg.mL-1 125 µL 10 mL 1250 ng.mL-1 CS6 100 µg.mL-1 250 µL 10 mL 2500 ng.mL-1

44

4.2.2.2 Preparo de amostras de plasma padrão da curva de

calibração dos enantiômeros (R)-metoprolol e (S)-metoprolol

As amostras de plasma padrão das curvas de calibração foram preparadas diariamente a partir de soluções de trabalho padrão de 50 ng.mL-1_, 100 ng.mL-1_{, 200 ng.mL}-1_{, 500 ng.mL}-1_{, 1250 ng.mL}-1 _{e 2500 ng.mL}-1 _{para cada} enantiômero de metoprolol em água:metanol (90:10, v/v). Tomaram-se alíquotas de 50 µL de solução de trabalho padrão de cada enantiômero de metoprolol e 20 µL de solução-padrão de ofloxacino a 100 ng.mL-1 _em água:metanol (90:10, v/v). Adicionaram-se 200 µL de plasma branco e as amostras foram homogeneizadas em agitador de tubos tipo vórtex por 30 segundos. O Quadro 7 apresenta as diluições realizadas para obtenção das amostras de plasma padrão da curva de calibração.

Quadro 7: Preparo das amostras de plasma padrão da curva de calibração

para (R)-metoprolol e (S)-metoprolol.

Amostra de plasma padrão Concentração da solução de trabalho padrão Volume de solução de trabalho padrão Volume de plasma branco Concentração final CC1 50 ng.mL-1 _{50 µL 200 µL 10 ng.mL}-1 CC2 100 ng.mL-1 _{50 µL 200 µL 20 ng.mL}-1 CC3 200 ng.mL-1 _{50 µL 200 µL 40 ng.mL}-1 CC4 500 ng.mL-1 50 µL 200 µL 100 ng.mL-1 CC5 1250 ng.mL-1 50 µL 200 µL 250 ng.mL-1 CC6 2500 ng.mL-1 50 µL 200 µL 500 ng.mL-1

4.2.2.3 Preparo das soluções de trabalho padrão de controle de

qualidade para os enantiômeros (R)-metoprolol e (S)-

metoprolol

As soluções de trabalho padrão de controle de qualidade foram preparadas a partir das soluções estoque padrão dos enantiômeros (R)- metoprolol e (S)-metoprolol na concentração de 100 µg.mL-1_{, transferindo-se} alíquotas adequadas para balões volumétricos e completando-se o volume com água:metanol (90:10, v/v), conforme descrito no Quadro 8.

As soluções obtidas foram acondicionadas em frascos de vidro âmbar e armazenada em geladeira à temperatura de 4ºC.

Quadro 8: Preparo das soluções padrão de controle de qualidade (CQ) para

(R)-metoprolol e (S)-metoprolol. Solução de trabalho padrão Concentração da solução estoque padrão Volume de solução estoque padrão

Volume final Concentração final

CQA 100 µg.mL-1 _{500 µL 25 mL 2000 ng.mL}-1

CQM 100 µg.mL-1 _{500 µL 50 mL 1000 ng.mL}-1

CQB 100 µg.mL-1 500 µL 500 mL 100 ng.mL-1

4.2.2.4 Preparo de amostras de plasma de controle de

qualidade para os enantiômeros (R)-metoprolol e (S)-

metoprolol

Para preparação das amostras de plasma de controle de qualidade alto (CQA, 400 ng.mL-1_{), médio (CQM, 200 ng.mL}-1_{) e baixo (CQB, 20 ng.mL}-1₎ transferiram-se alíquotas de soluções de trabalho padrão de metoprolol em

46

água:metanol (90:10, v/v), nas concentrações de 100 ng.mL-1, 1000 ng.mL-1 ou 2000 ng.mL-1, conforme descrito no Quadro 8, para balões volumétricos de 25 mL. A seguir, adicionou-se lentamente o plasma branco e homogeneizou-se gentilmente para evitar a formação de espuma. Após completar o volume agitou-se vigorosamente para garantir a homogeneização.

Após o preparo, estas soluções foram aliquotadas em frascos de polipropileno de 2 mL e armazenadas em freezer a - 20°C.

Quadro 9: Preparo das amostras de plasma de controle de qualidade para (R)-

metoprolol e (S)-metoprolol. Amostra de plasma de controle de qualidade Concentração da solução de trabalho padrão Volume de solução de trabalho padrão Volume de plasma branco Concentração final CQA 2000 ng.mL-1 _{5 mL 25 mL 400 ng.mL}-1 CQM 1000 ng.mL-1 _{5 mL 25 mL 200 ng.mL}-1 CQB 100 ng.mL-1 5 mL 25 mL 20 ng.mL-1

4.2.2.5 Tratamento das amostras de plasma para quantificação

dos enantiômeros (R)-metoprolol e (S)-metoprolol

Para o procedimento de purificação das amostras de plasma humando contendo os enantiômeros do metoprolol foi utilizado o mesmo método desenvolvido para quantificação do (R,S)-metoprolol, descrito no item 4.2.1.4, utilizando precipitação de proteínas com acetonitrila. Ao final do procedimento as amostras foram ressuspendidas em 250 µL de fase móvel para injeção em CLAE.

4.2.2.6 Condições cromatográficas para quantificação dos

enantiômeros (R)-metoprolol e (S)-metoprolol em plasma

humano

Para a quantificação dos enantiômeros (S)-metoprolol e (R)-metoprolol empregou-se coluna cromatográfica quiral Chiralcel OD-R com 150 mm de comprimento e 4,6 mm de diâmetro interno, contendo partículas de 5 µm.

A fase móvel foi composta por uma mistura de hexano:etanol:dietilamina, na proporção de 90:10:0,1 (v/v). A fase móvel foi degaseificada em banho de ultrassom por 15 minutos. Utilizou-se o fluxo de 1,0 mL/min. A temperatura do forno foi de 25°C. Foram injetados 50 µL da amostra e os comprimentos de onda para detecção por fluorescência para o metoprolol foram de 230 nm (excitação) e 305 nm (emissão) e de 338 nm (excitação) e 425 nm (emissão) para o padrão interno ofloxacino.

4.2.2.7 Validação do método enantioseletivo para quantificação

de (R)-metoprolol e (S)-metoprolol em plasma

A validação foi realizada através da determinação de especificidade, recuperação, limite de quantificação, linearidade, precisão, exatidão e estabilidade para cada enantiômero, conforme estabelecido pela RE 899 da ANVISA (Brasil, 2003) e da mesma forma que descrito para a validação do método para quantificação de (R,S)-metoprolol (item 4.2.1.7).

4.2.2.8 Quantificação de (R)-metoprolol e (S)-metoprolol nas

amostras de plasma dos voluntários

As amostras de plasma de voluntários que receberam metoprolol foram analisadas utilizando o processo de purificação e o método cromatográfico descritos nos itens 4.2.1.4 e 4.2.2.4, respectivamente. O procedimento

48

realizado foi o mesmo que para o método descrito para análise de (R,S)- metoprolol, descrito no item 4.2.1.8, com a diferença de que para cada corrida cromatográfica foram incluídas curvas de calibração para cada enantiômero e grupos de amostras de controle de qualidade também para cada enantiômero.