Desenvolvimento e validação de método indicativo de estabilidade por CLAE para furosemida matéria-prima

No que se refere ao desenvolvimento do método por CLAE para estudos de estabilidade de FUR, os métodos disponíveis na literatura e as análises realizadas preliminarmente, permitiram delinear os experimentos de desenvolvimento por design experimental.

De modo simplificado, o desenvolvimento do método por CLAE utilizou duas ferramentas estatísticas: o fatorial fracionado (cinco fatores avaliados e definidos manualmente, 2n-1 = 25-1), seguido pela análise da superfície de resposta definida utilizando o programa Design Expert® (dois fatores avaliados, 22 + (-√2) + (+√2)). As proporções de fase aquosa e fase orgânica foram definidas a partir do cálculo da força total da mistura, adotando-se volumes de metanol e acetonitrila equivalentes

conforme a força de cada solvente. Os parâmetros avaliados estão representados no Quadro 5 e no Quadro 6 (KRULL et al., 2008; DEJAEGHER; DURAND; VANDER-HEYDEN, 2009; DEJAEGHER; VANDER-HEYDEN, 2009; KRULL et al., 2009; DEJAEGHER, B.; VANDER-HEYDEN, 2011; SNYDER; KIRKLAND; DOLAN, 2011; VOGT; KORD, 2011).

Quadro 5 - Detalhamento do fatorial fracionado Fator 1: coluna cromatográfica1 Fator 2: pH 2 Fator 3: solvente orgânico3 Fator 4: tampão4 Fator 5: temperatura5 A B C D E = A.B.C.D 1 - - - - + 2 + - - - - 3 - + - - - 4 + + - - + 5 - - + - - 6 + - + - + 7 - + + - + 8 + + + - - 9 - - - + - 10 + - - + + 11 - + - + + 12 + + - + - 13 - - + + - 14 + - + + - 15 - + + + - 16 + + + + + Análise Legenda: Fator 1: - (C18); + (C8). Fator 2: - (pH 3,0); + (pH 5,0).

Fator 3: - (Metanol 31 %); + (Acetonitrila 25 %).

Fator 4: - (Tampão acetato 50 mM); + (Tampão fosfato 50 mM). Fator 5: - (25 oC); + (35 oC).

Quadro 6 - Detalhamento da análise composta central Análise Fator 1: [Acetonitrila] (%) Fator 2: pH

1 17,9 4,0 2 25,0 2,6 3 20,0 5,0 4 30,0 5,0 5 25,0 5,4 6 25,0 4,0 7 20,0 3,0 8 32,1 4,0 9 25,0 4,0 10 25,0 4,0 11 30,0 3,0

Foram analisadas soluções de FUR substância química de referência (SQR) e solução amostra submetida à degradação em luz UV 254 nm por uma hora. Ambas as soluções encontravam-se na concentração de 1 mg/mL. A solução de SQR foi preparada em metanol. No caso da amostra, após 1 hora em câmara de luz, alíquota de 250 µL da solução de 1 mg/ml foi transferida para balão volumétrico qsp 10 mL de diluente (metanol:água 50:50, v/v). A mesma diluição foi feita para a solução de SQR, para uma concentração final de FUR de 25,0 µg/mL (sem exposição à luz).

Os cromatogramas obtidos foram avaliados de acordo com os seguintes parâmetros: o tempo de retenção de FUR, a resolução entre os picos FUR/produtos de degradação e a simetria do pico relativo à FUR. O design realizado permitiu determinar as seguintes condições experimentais como ideais: coluna cromatográfica Phenomenex C8 (150 x 4,6 mm, 5,0 µm), temperatura do forno de 25 oC, volume de injeção 20 µL e eluição em gradiente, conforme Tabela 1. Optou-se por utilizar um gradiente de fase móvel tendo em vista a diferença de polaridade dos produtos de degradação da FUR e objetivando um tempo de corrida cromatográfica razoavelmente curto.

Tabela 1- Programa do gradiente utilizado no método indicativo de estabilidade. Tempo

(minutos)

Proporção de acetonitrila (%)

Proporção de tampão fosfato de potássio 50 mM pH 4,0 (%) 0 13 87 1 13 87 2 30 70 9 30 70 10 13 87 15 13 87

O tampão fosfato foi preparado a partir de solução KH2PO4 50 mM, pH ajustado para 4,0 com ácido fosfórico. A fase móvel foi misturada na proporção especificada pelo próprio sistema cromatográfico Shimadzu. As soluções separadas foram filtradas sob vácuo e membrana de Nylon 0,45 µm, com posterior desgaseificação em banho de ultra-som por 15 minutos.

Com relação ao preparo das amostras analisadas, padronizou-se utilizar solução-estoque do fármaco em metanol e proceder diluição de alíquota apropriada em metanol:água (50:50, v/v), denominado diluente. O método foi validado conforme BRASIL (2003), ICH (2005) e USP (2007), quanto aos parâmetros: especificidade, linearidade, precisão, limites de detecção (LD) e quantificação (LQ), exatidão e robustez.

Especificidade: avaliada por meio de estudos de degradação forçada de solução SQR de FUR sob condições hidrolíticas (ácida e alcalina), oxidativas e fotolíticas (SINGH; BAKSHI, 2000). Os tempos de análise e submissão às condições de degradação forçada foram definidos tendo por base a porcentagem de degradação observada e os protocolos internos padronizados no laboratório. Além disso, estudos avaliando a interferência/coeluição dos formers utilizados nos experimentos de cocristalização também foram realizados (ICH, 1996; 2003).

Nas condições hidrolíticas, amostras da matéria-prima da FUR foram submetidas à meio ácido (ácido clorídrico 0,1 N; refluxo por 8 horas) e alcalino (hidróxido de sódio 1 N, refluxo por 12 horas). As amostras, na concentração de 1 mg/mL, foram preparadas transferindo- se para balão volumétrico 25,0 mg da matéria-prima e 12 mL de metanol qsp 25 mL de HCl 0,1 N ou NaOH 1 N, dependendo do tipo de análise. Este sistema foi mantido em refluxo. Após o tempo indicado, alíquota de 250 µL desta solução foi retirada e neutralizada em balão

volumétrico de 10 mL com 250 µ L de NaOH 0,1 N ou HCl 1 N, respectivamente. Por fim, o volume foi ajustado com diluente para uma concentração final de 25,0 µg/mL. Também foram analisados os tempos-zero das reações.

A estabilidade da FUR em condições oxidativas foi avaliada em peróxido de hidrogênio 30 %, à temperatura ambiente, por período de 24 horas. A solução inicial foi preparada transferindo-se para balão volumétrico 25,0 mg da matéria-prima e 12 mL de metanol qsp 25 mL de H2O2 30 %. Posteriormente, uma alíquota de 250 µL desta solução foi retirada e transferida para um balão volumétrico de 10 mL qsp diluente, consistindo no tempo zero. O mesmo procedimento foi realizado após 24 horas, retirando-se alíquota de 250 µL da solução inicial qsp 10 mL de diluente para uma concentração final de 25,0 µg/mL.

Soluções de FUR a 1 mg/mL também foram submetidas à luz ultravioleta 254 nm, em câmara de luz UV apropriada. Estas soluções foram preparadas em metanol, acetonitrila, metanol:água (50:50, v/v) e acetonitrila:água (50:50, v/v). Após 1 hora de exposição à luz, em cubetas de quartzo, 250 µL das soluções iniciais foram transferidas para balão volumétrico qsp 10 mL de diluente para uma concentração teórica final de 25,0 µg/mL de FUR. Além disso, soluções na concentração de 1 mg/mL de FUR preparadas para hidrólise ácida/básica foram também expostas à luz UV 254 nm a fim de avaliar possível efeito protetor dependente de pH.

As soluções dos formers foram obtidas de forma semelhante à FUR SQR, sendo analisadas nas concentrações finais de 25,0 µg/mL em diluente.

Linearidade: determinada pela análise de 5 concentrações crescentes de FUR SQR na faixa de 5,0 – 50,0 µg/mL, em triplicata, em três dias diferentes. Estas soluções foram preparadas a partir de solução- estoque a 500 µg/mL em metanol. A linearidade foi avaliada pela análise da regressão linear, a qual foi calculada pelo método dos mínimos quadrados e pela análise da variância (ANOVA) (Microsoft Office Excel 2007).

Limites de detecção (LD) e quantificação (LQ): calculados a partir da reta obtida na linearidade. LD e LQ correspondem a, respectivamente, 3,3r/S e 10r/S, onde r é o desvio padrão do intercepto e S é a inclinação da curva analítica.

Precisão: avaliada por meio dos coeficientes de variação percentual obtidos durante a determinação de FUR em matérias-primas comerciais nos testes de repetibilidade (intradia, n=6) e precisão intermediária (inter-dias, n=3). A concentração analítica teórica compreendeu a 25,0 µg/mL (ponto médio aproximado da curva analítica).

Exatidão: verificada pelo teste de recuperação de quantidades conhecidas de FUR SQR adicionadas a soluções de amostras de matérias-primas comerciais. Foram preparadas soluções metanólicas de SQR e amostra, ambas na concentração teórica de 100,0 µg/mL. A partir delas, foram preparadas três amostras compreendendo três níveis de concentração nominal (ponto médio aproximado da curva analítica) em balão volumétrico de 25 mL (Tabela 2): 80 % (R1 = 20 µg/mL), 100 % (R2 = 25 µg/mL) e 120 % (R3 = 30 µg/mL). As análises foram feitas em triplicata, em dias diferentes, e avaliadas como porcentagem de recuperação de FUR SQR.

Tabela 2 - Preparo das soluções para o teste de recuperação de FUR em matéria- prima, em metanol:água (50:50, v/v), utilizando CLAE.

Solução Volume (mL) solução FUR matéria-prima (100 µg/mL) Volume (mL) solução FUR padrão (100 µg/mL) Concentração FUR final (µg/mL) Amostra 4,00 - 16,0 R1 4,00 1,00 20,0 R2 4,00 2,25 25,0 R3 4,00 3,50 30,0 Padrão - 4,00 16,0

Robustez: analisada a partir de pequenas e deliberadas modificações nas condições do método, como o comprimento de onda de detecção, o fluxo, a temperatura do forno e a proporção de solvente orgânico na fase móvel.

3.3.2 Desenvolvimento e validação de método de dissolução