Detecção de mutações pontuais associadas a resistência a antibióticos

Foram desenvolvidas quatro sondas para a detecção de polimorfismos presentes no gene rpoB que estão associados a resistência a rifampicina -

sondas Rpo516WT e Rpo531WT, sondas com sequências complementar ao gene wild-

type, e as sondas Rpo516MUT e Rpo531MUT, com sequências complementares ao

gene mutado.2

Na perspectiva de optimizar o sistema para a discriminação de mutações pontuais foi avaliada a influência da força iónica na estabilidade cinética do sistema. Foi estudada a cinética de agregação da sonda Rpo516WT, em função da força iónica, na presença de alvo complementar, não complementar, e alvo com mismatch. Os resultados representam a variação de r(Abs.) em função da força iónica do meio (Figura 11).

Figura 11: Cinética de Agregação de Au-nanossondas em função da força iónica

Sonda Rpo516WT; Valores de r(Abs.) para teste efectuados com sonda a 2,5 nM, em tampão fosfato pH=8; Vermelho, alvo complementar

pRpoWT(PCR) a 80 µg/mL; Cinzento, pRpoA516V(PCR) (alvo com missmatch) a 80 µg/mL, Azul, alvo não complementar, pANKA(PCR) a

80 µg/mL. Indução de agregação efectuada pela adição de gradiente de concentração de MgCl2. Estudo cinético efectuado com leituras de

absorvância em intervalos de 1 minuto.

2

A terminologia 516 e 531 é referente ao codão do gene em que se encontra o polimorfismo que se pretende detectar.

  0   0.02   0.04   0.06   0.08   0.1   0.12   0   0.01   0.02   0.03   0.04   0.05   0.06   0.07   0.08   0.09   [d (R a zã o A b s .5 2 4 /6 0 0 )/ d t] (m in -1 ) Força  Iónica  (M)  

Verifica-se que existe uma relação entre a força iónica e a cinética de agregação. O resultado apresentado é mais uma evidência da estabilização criada pela hibridação de alvos à superfície das nanossondas. No entanto, a presença de alvos com mismatch esta estabilização não é tão efectiva, traduzindo-se numa cinética de agregação mais elevada. É possível verificar que para I=0,07 M existe a maior diferenciação de velocidade de agregação. Utilizando esta condição foram efectuados testes colorimétricos para verificar a capacidade de distinção entre os diferentes alvos. Os resultados representam a razão de absorvância r(Abs) obtida em função do tempo para alvo complementar, não complementar e mismatch para a força iónica de 0,07 M (Figura 12).

Figura 12: Cinética de agregação de Au-nanossondas, na presença de diferentes alvos.

Sonda Rpo516WT; Valores de r(Abs.) para teste efectuados com sonda a 2,5nM, em tampão fosfato pH=8; Vermelho: alvo complementar

pRpoWT(PCR) a 80 µg/mL; Cinzento: pRpoA516V(PCR) (alvo com missmatch) a 80 µg/mL; Azul: alvo não complementar, pANKA(PCR) a

80 µg/mL. Indução de agregação efectuada pela adição MgCl2 para força iónica final de 0,07 M. Leituras de absorvância efectuadas em

intervalos de 1 minuto.

Os resultados obtidos permitem verificar a variação da extensão de agregação ao longo do tempo, onde se demonstra uma optimização de discriminação no intervalo [15;30] minutos. Nestas condições é possível obter r(Abs.)>1,1 para o alvo complementar; 1<r(Abs.)<1,1 para o alvo com mismatch e r(Abs.)<1 para o alvo não complementar. Para discriminar o alvo com mismatch como teste negativo a leitura de absorvância terá

0.8   0.9   1   1.1   1.2   1.3   1.4   1.5   1.6   1.7   0   10   20   30   40   50   r(A b s .5 2 4 /6 0 0 n m ) Tempo  (min.)  

de ser efectuada ao fim de 45 minutos após a adição de electrólito. Verifica-se assim que o sistema possibilita a diferenciação entre alvos complementares e alvos contendo

mismatch, podendo esta discriminação ser modelada. Mais uma vez verifica-se que o

aumento de especificidade do sistema provoca a diminuição da sensibilidade.  

Uma vez optimizado o método para a detecção de mutações pontuais, foram efectuados testes colorimétricos com as sondas desenvolvidas. Os testes foram efectuados recorrendo aos pares de sondas Rpo516WT / Rpo516MUT e Rpo531WT / Rpo531MUT com produtos de PCR de pRPOWT, pRpoA516V, pRpoS531L e pANKA. Foram utilizadas concentrações de DNA alvo elevadas de forma a não existir uma elevada dependência entre a concentração e a resposta do sensor. A medição de absorvância foi efectuada 20 minutos após a adição de electrólito para se obter diferenciação entre o alvo negativo é o alvo mutado (Figura 13 e 14).

Figura 13: Detecção de mutações que conferem resistência a antibióticos; Sondas Rpo516

Valores de r(Abs.) para teste efectuados com sonda a 2,5 nM, em tampão fosfato pH=8; a) Sonda Rpo516WT: Vermelho: alvo complementar pRpoWT(PCR) a 80 µg/mL; Cinzento: pRpoA516V(PCR) (alvo com mismatch) a 80 ug/mL; Azul: alvo não complementar,

pANKA(PCR) a 80 µg/mL. b) Sonda Rpo516MUT; Vermelho: alvo complementar pRpoA516V(PCR) a 80 µg/mL; Cinzento:

pRpoWT(PCR) (alvo com mismatch) a 80 µg/mL; Azul: alvo não complementar, pANKA(PCR) a 80 µg/mL. Indução de agregação

Figura 14: Detecção de mutações que conferem resistência a antibióticos; Sondas Rpo531

Valores de r(Abs.) para teste efectuados com sonda a 2,5 nM, em tampão fosfato pH=8; a) Sonda Rpo531WT; Vermelho: alvo complementar pRpoWT(PCR) a 80 µg/mL; Cinzento: pRpos531L(PCR) (alvo com mismatch) a 80 µg/mL; Azul: alvo não complementar,

pANKA(PCR) a 80 µg/mL. b) Sonda Rpo531MUT; Vermelho: alvo complementar pRpoS531L(PCR) a 80 µg/mL; Cinzento:

pRpoWT(PCR) (alvo com mismatch) a 80 µg/mL; Azul: alvo não complementar, pANKA(PCR) a 80 ug/mL. Indução de agregação

efectuada pela adição MgCl2 para força iónica final de 0,18 M. Leituras de absorvância efectuadas 15 minutos após a adição de electrólito.

Os resultados obtidos permitem verificar que o sistema consegue detectar mutações pontuais em ambas as regiões em estudo. As sonda Rpo516WT e Rpo531WT apresentam resultado positivo para o produto de PCR de pRpoWT (r(Abs.)>1,1); resultado na zona cinzenta para os produtos de PCR pRpoA516V e pRpoS531L respectivamente (1<r(Abs.)<1,1) e resultado negativo para o produto de PCR de pANKA (r(Abs.)<1). A validação do resultado é obtida pela análise dos resultados das sondas Rpo516MUT e Rpo531MUT que apresentam resultado positivo para o produto de PCR de pRpoA516V e pRpoS531L respectivamente (r(Abs.)>1,1); resultado na zona cinzenta para os produtos de PCR pRpoWT (1<r(Abs.)<1,1) e resultado negativo para o produto de PCR de pANKA (r(Abs.)<1).

A metodologia proposta recorre a um par de sondas, no qual uma das sondas é complementar ao alvo wild-type e a outra complementar ao alvo mutado. Deste modo existe uma confirmação do resultado, sendo possível retirar efeitos de estabilização inespecífica.

3.6 Validação do sistema de nanossondas  

Em todo o desenvolvimento do sistema apresentado recorreu-se a alvos controlados, extraídos e amplificados a partir de clones controlo, utilizando metodologias de purificação dos alvos bastante rigorosas. Uma vez que se pretende desenvolver este sistema como um método de diagnóstico rápido, é importante analisar o comportamento do sistema desenvolvido em amostras biológicas, comparando o resultado com os resultados obtidos por testes de referência no diagnóstico de M. tuberculosis.

Foram efectuados testes colorimétricos de 144 amostras previamente testadas com quatro métodos padrão. Dois testes padrão específicos Acid-Fast bacillus (AFB) e

Lowenstein-Jensen (LJ), e dois métodos de amplificação por PCR Innogenetics line probe assay (INNO-Lipa PCR) e INNO-Lipa Nested PCR.

As amostras testadas foram os produtos resultantes das reacções de PCR do método

Lipa Nested PCR. Estas amostras foram quantificadas, por espectrofotometria de UV e

verificou-se que apresentavam concentrações de ácidos nucleicos inferior ao limite de detecção analisado anteriormente para a sonda MTub ([DNA<15ug/mL]. Desta forma foram alteradas as condições de hibridação de forma a permitir a análise. Foi utilizado um tampão de hibridação com força iónica mais elevada - 0,2 M NaCl. Baseado nos resultados obtidos, procedeu-se a uma comparação com os outros métodos (Anexo E e F). Verifica-se que o método utilizado detectou 19 amostras como Positivo, 83 como Negativo e 40 amostras como Indefinido.