A detecção in situ de TNF-α e IL-1 nas lesões de rins de ratos dos grupos G1 e G2 pode ser visibilizada nas figuras A, B, C, D e E. Na tabela 8 está representada a intensidade da imunomarcação para citocinas, que foi classificada como: + leve, ++ moderada e +++ intensa marcação das células epiteliais tubulares e mesangiais glomelulares. A marcação positiva foi detectada como coloração marrom acastanhada de padrão citoplasmático granular e de membrana celular.
A imunomarcação de TNF-α no grupo G1 (controle) e G2 (tratado com cetoprofeno) apresentou-se intensa nas células epiteliais tubulares e nas mesangiais glomerulares. No grupo G2, a imunomarcação da IL-1 apresentou acentuada diminuição da expressão tanto nas células tubulares como nas mesangiais glomerulares. No entanto, a imunomarcação da IL-1 no grupo G1 apresentou-se intensa tanto em células epiteliais tubulares como em células mesangiais glomerulares.
Tabela 8 – Escores de intensidade para a imunomarcação de IL-1 e TNF- Į nos rins de ratos de G1 (controle) e G2 (cetoprofeno)
Escore de intensidade da imunomarcação
IL-1 TNF- Į
G2 + +++
G1 +++ +++
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Figura 7 – Imunomarcação de rins de ratos, com anticorpo primário antiIL-1 e antiTNF-Į. Técnica ABC, DAB e contracoloração hematoxilina de Harris. 400x. A – IL-1, animais tratados com cetoprofeno (G2). B – IL-1, animais sem tratamento (G1). C – TNF- Į, animais tratados com cetoprofeno (G2). D - TNF- Į, animais sem tratamento (G1). E – Controle negativo. B A C E D
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O desenvolvimento de disfunção renal pós-operatória é causa de morbidade e mortalidade que segue cirurgias de grande porte, principalmente as cardiovasculares. Embora a literatura apresente inúmeras estratégias que podem prevenir este evento renal, nenhuma, ainda, é tão eficaz quanto a manutenção de normovolemia. Neste presente trabalho experimental, foi provocada hemorragia de moderada intensidade, mas com reposição hidroeletrolítica apenas de perdas mínimas. Espera-se, portanto, que não tenha sido preservada a volemia normal.
O ato anestésico-cirúrgico resulta na liberação de hormônios catabólicos e citocinas (26). Outro efeito importante, e que é reforçado pelo jejum pré-operatório, é o aumento da secreção de hormônio antidiurético, com conseqüente retenção de água. Contudo, há sempre perdas intra-operatórias, que compreendem as de sangue ou só de fluidos intravasculares, existindo, por isso, rotina para se reporem ambas e ainda manter o requerimento de água.
Alta porcentagem de sangue irriga a córtex renal (cerca de 5 mL. min-1. g-1), mas a córtex extrai apenas 18% do total de oxigênio que aí aporta. Por outro lado, para a região medular, a quantidade de fluxo sangüíneo que chega é bem menor (cerca de 0,03 mL. min-1. g-1), mas a extração de seu oxigênio é alta – aproximadamente 79% da quantidade desse gás que é disponibilizada (26). Uma série de mecanismos de controle é responsável pelo balanço entre suprimento e consumo de oxigênio medular. A quebra deste controle deixa a região mais externa da medula renal suscetível a episódios agudos de agressão hipóxica, que podem desencadear necrose tubular aguda, especialmente das regiões com alça ascendente fina. Assim, esta necrose tubular aguda já se manifestaria com decréscimo de 40-50% do fluxo sangüíneo renal.
Os mediadores que podem afetar o fluxo sangüíneo medular e alterar a magnitude de qualquer agressão isquêmica são: 1) os vasodilatadores – óxido nítrico, prostaglandina E2, adenosina, dopamina, urodilatina (análogo do peptídeo natriurético atrial); 2) vasoconstritores – endotelina, angiotensina II, vasopressina; 3) retroalimentação túbulo-glomerular – quando há reabsorção insuficiente de sódio pelos túbulos renais, este mecanismo reflexo leva a constrição glomerular aferente, assim reduzindo a filtração e a liberação e reabsorção de soluto tubular; 4) fatores de crescimento tubular medular – fator I de crescimento semelhante à insulina, fator de
crescimento epidérmico e fator de necrose tumoral, os quais em diferentes modelos animais mostraram que aceleram a recuperação após insuficiência renal aguda (26).
Como o trabalho associado à reabsorção de sal e água predispõe ao aparecimento de dano medular hipóxico, o rim terá vantagem terapêutica quando há volume circulante e carga de íons adequados, estando reduzida a necessidade de concentração da urina. Desse modo, haverá menor utilização de oxigênio medular. De modo contrário, as agressões associadas à hipóxia serão piores quando estiverem presentes outros fatores, como os AINEs, angiotensina II, alguns antibióticos, hipertrofia renal, íon cálcio, mioglobina, hiperbilirrubinemia e contrastes (26).
Combinação de retroalimentação túbulo-glomerular e excessiva estimulação do sistema renina-angiotensina muitas vezes leva a insuficiência renal aguda prolongada. A produção renal de prostaglandinas, substâncias vasodilatadoras, preserva a função renal durante aumento da atividade do sistema renina-angiotensiona ou do sistema simpático renal. As ações vasoconstritoras da norepinefrina e angiotensina II são contrabalançadas pelas ações vasodilatadoras das prostaglandinas e a resistência renal não aumenta drasticamente, uma vez que quando a vasoconstrição é intensa e de longa duração pode ocorrer necrose tubular aguda (27).
Neste presente trabalho experimental, o maior estresse ocorreu durante períodos de hemorragia e hipotensão. No grupo G1, a redução da pressão arterial média foi intensa, havendo diferença estatisticamente significativa entre os momentos M1 e M3. Este perfil era o esperado, já que os animais sofreram sangria de 30% da volemia. Os animais do grupo G2 também apresentaram redução da pressão arterial média entre os momentos M1 e M3, porém não houve diferença significativa.
A isquemia causada por choque hipovolêmico leva o rim à falência como resultado de morte celular. A isquemia é o gatilho para uma série de distúrbios metabólicos que culminam com a morte celular, que ocorre por necrose ou apoptose. A necrose celular é o resultado da combinação de efeitos deletérios precipitados por agressão celular grave (28).
Rins isquêmicos sofrem de perda de adenosina trifosfato (ATP) devido à redução da disponibilidade de oxigênio e nutrientes (29). A gravidade e a duração necessárias de isquemia para gerar insuficiência renal aguda no homem são
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desconhecidas, já que existe um intervalo de transição entre o estágio pré-renal e a necrose tubular aguda.
Esta pesquisa mimetizou, em ratos, uma situação real de perda volêmica sem prevenção de hipotermia, sendo observados os efeitos da isquemia renal resultante. Ambos os grupos, já em M1, apresentavam animais hipotérmicos. Nenhum método de aquecimento foi realizado nos animais estudados, e assim se reproduziu a situação de hipotermia que geralmente ocorre durante o ato operatório e que se intensifica em situação de hemorragia aguda.
Segundo Pannen (30), a incidência de hipotermia perioperatória é freqüentemente subestimada já que em 50% dos pacientes ocorre, no mínimo, redução de 2°C na temperatura corporal, caso medidas de aquecimento não sejam realizadas neste período. Hipotermia foi observada em ambos os grupos estudados desde o momento inicial da pesquisa, o que é plausível uma vez que o pentobarbital sódico induz a diminuição da temperatura corporal (31). Assumindo-se que ela protege o rim (32), ou não (33), poderia ter interferido nos resultados observados se ela não tivesse ocorrido nos animais dos dois grupos estudados. Yoshitomi et al. (33) observaram perda de células tubulares, necrose epitelial, edema intersticial e posterior desenvolvimento de insuficiência renal aguda após hipotermia acidental.
O hematócrito é a relação entre o volume de hemácias circulantes e o volume plasmático. Não é um bom indicador das alterações agudas da volemia, uma vez que, durante episódios hemorrágicos com perda de sangue total, a proporcionalidade entre volume plasmático e hemácias mantém-se até que mecanismos renais venham a atuar na preservação de íons sódio (34).
Tracey et al. (35) administraram TNF-Į a ratos e observaram que ocorreu hemoconcentração. Com o estresse anestésico-cirúrgico ocorrido nos dois grupos experimentais, era esperado aumento de citocinas inflamatórias e isto pode ser observado nos resultados. O grupo que recebeu cetoprofeno (G2) apresentou resultado maior que o normal de TNF-Į e IL-1 em M1 e M3. Os AINEs são agentes que reduzem a formação de prostaglandinas e estas atuam em via de retroalimentação negativa na formação de citocinas. Deste modo, sem a inibição das prostaglandinas, as citocinas estariam com concentração sérica elevada e elas determinam vasodilatação e hemoconcentração. Em G2, o hematócrito é significativamente maior que em G1.
Observando-se e analisando-se os resultados de hematócrito, de M1 para M3, pode-se quantificar a redução como de 23% em G1 e 15% em G2.
O AINE estudado nesta pesquisa, o cetoprofeno, é uma mistura de duas formas enantioméricas, isômeros R e S, em razão da presença de um átomo de carbono assimétrico na posição Į da função carbonil. O enantiômero R do cetoprofeno é conhecido por sofrer inversão quiral para enantiômero S, in vivo, em várias espécies animais, exceto no homem e na cobaia (36, 37). É um antiinflamatório que bloqueia a ciclooxigenase constitutiva COX-1 e aquela que pode ser induzida, a COX-2, inibindo, como conseqüência, a produção de prostaglandinas (38). A ação antinociceptiva e antiinflamatória dos AINEs estaria relacionada, também, à redução da produção de citocinas pró-inflamatórias pela ação inibitória no fator nuclear NF-țB (39).
Embora o papel antiinflamatório dos dois enantiômeros não esteja ainda completamente caracterizado, sabe-se que o R-cetoprofeno é inibidor fraco da COX, sendo aproximadamente de 100 a 1000 vezes menos potente que o enantiômero S, in
vitro (37). Sendo assim, supõe-se que ele contribuiria pouco com o efeito
antiinflamatório, mas estaria principalmente associado ao efeito analgésico. Por outro lado, o S-cetoprofeno inibe a produção de PGE2de modo eficaz, sendo considerado o maior responsável pela atividade antiinflamatória da forma racêmica e, também, pelos seus efeitos colaterais, como o aumento das citocinas inflamatórias (40).
Muitas citocinas têm papel essencial na determinação do processo inflamatório, especialmente IL-1 e TNF-Į (41). As duas são consideradas mediadoras fundamentais das respostas biológicas ao lipopolissacarídeo bacteriano (LPS, também chamado endotoxina), por exemplo. A IL-1 compreende dois polipeptídeos distintos, IL-1Į e IL- 1ȕ, que se ligam aos mesmos receptores de membrana e produzem respostas biológicas similares. Em pacientes com inflamação ativa, as concentrações plasmáticas de IL-1 estão elevadas.
O papel dos AINEs na inflamação apresenta múltiplas facetas. Por exemplo, o agente antiinflamatório etodolaco, em outras espécies animais e em diferentes órgãos, apresenta respostas de diferentes nuances. Assim, Inoue et al. (42) demonstraram que ele suprime a biossíntese de PGE2 estimulada pela IL-1ȕ em condrócitos de coelhos, mas tem ação menor de supressão da biossíntese espontânea de PGE2 em células epiteliais gástricas de coelhos e em células de rins de cães.
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A IL-1, importante produto da estimulação de monócitos, é responsável por diversos efeitos biológicos e, dentre os sistêmicos de interesse para a presente pesquisa, podem ser aqui destacados a febre (o aumento da temperatura é por ação hipotalâmica, que o TNF-Į também apresenta) e a hipotensão. In vitro, obtém-se formação de coágulo e congestão vascular. A IL-1 aumenta dramaticamente os metabólitos do ácido aracdônico em uma variedade de células e o aumento da síntese da prostaglandina E2é responsável por suas propriedades inflamatórias. O TNF-Į divide com a IL-1 muitos dos seus efeitos sistêmicos e locais, o que não ocorre com alguns efeitos observados in
vitro. A combinação de TNF-Į e IL-1 freqüentemente provoca resposta inflamatória
bastante aumentada e, como as duas citocinas são produzidas em grandes quantidades após estímulo apropriado, o resultado final para o organismo é o efeito combinado de ambas (43).
O TNF-Į é uma citocina com papel chave em inflamação, como ficou demonstrado pela eficácia clínica de anticorpos antiTNF-Į em artrite reumatóide e doença de Crohn (44, 45). Paradoxalmente, entretanto, os AINEs aparentemente aumentariam, em vez de inibir, a produção de TNF-Į. De fato, há relatos de que os AINEs induzem diretamente a liberação de TNF-Į in vitro e in vivo (46, 47, 48).
Endres et al. (49) quantificaram a produção de IL-1ȕ, IL-1Į e TNF-Į pelas células mononucleares do sangue periférico, no homem. Encontraram que a quantidade de citocinas sintetizadas por essas células é regulada de maneira independente para IL-1 e TNF-α, mas apresenta correlação quando se fala de IL-1ȕ e IL-1Į, a produção de IL- 1ȕ aumenta com o uso, por via oral, de inibidores da ciclooxigenase.
Também, segundo Endres et al. (49), a maior produção de TNF-Į seria devida à inibição da síntese de PGE2, porque normalmente as prostaglandinas inibem a produção
in vitrode TNF-Į e IL-1. Desde que se sabe que as prostaglandinas são produzidas in vivoe in vitro sob estímulo das citocinas, este pode ser mecanismo de retroalimentação
(feedback) negativo que limita a produção de citocinas. O AINE ibuprofeno aumentou as concentrações sangüíneas de TNF-Į e IL-6 em voluntários humanos após ter-lhes sido injetada a endotoxina LPS (lipopolissacáride) (50). Em camundongos, Sironi et al. (51) também observaram que as prostaglandinas podem, fisiologicamente, prover regulação de feedback negativo de IL-6 e TNF-Į.
No presente estudo, o grupo que recebeu apenas pentobarbital sódico mostrou elevação sangüínea da citocina pró-inflamatórias TNF-Į já no primeiro momento do experimento (controle e coincidente com a primeira hemorragia). Este momento, M1, ocorreu após 60 minutos da administração do AINE cetoprofeno, em G2, e o tempo correspondente, em G1. Deve-se levar em consideração que a anestesia intraperitoneal já é uma agressão capaz de levar à resposta inflamatória, o mesmo acontecendo com a incisão no pescoço dos animais para a dissecção e canulação da veia jugular e artéria carótida. Este resultado de M1 pode ser visto como esperado.
Em M1 de G2, ambas as citocinas, TNF-Į e IL-1, estavam com valores significativamente mais altos que os normais e o de TNF-Į de G1. Em G2, foi administrado o cetoprofeno e, então, também se esperava este comportamento – a formação de prostaglandinas pelo ácido aracdônico estava bloqueada e estas substâncias inibem a formação de TNF-Į e IL-1, o que não ocorria em G1 (23, 49).
Ayala et al. (52) já haviam demonstrado, no camundongo, que a hemorragia, na ausência de trauma tecidual significativo, determinava aumento da liberação de TNF-Į sem que este fato fosse resultado de elevação de endotoxina no animal. Em seu experimento, as concentrações desta citocina eram altas com 30 minutos de hemorragia e permaneceram assim mesmo duas horas após ressuscitação, mas não após quatro horas.
Muitos estudos experimentais focalizaram-se na produção de TNF-Į em hemorragia grave (perda de 50% da volemia) ou hemorragia prolongada com restituição fluídica (53, 54, 55). Esta citocina pró-inflamatória foi bem identificada como a de maior importância durante os eventos de isquemia e reperfusão relacionados com a hemorragia (56, 57, 19). A TNF-Į expressa-se após hemorragia (54, 58), tem papel importante na inflamação excessiva, autodestrutiva, induzindo, no final, falência de múltiplos órgãos através da ativação de neutrófilos (59). Roumen et al. (60) já haviam pesquisado e encontrado, no homem, após trauma grave, choque hemorrágico e ruptura de aneurisma de aorta abdominal, concentração aumentada de TNF- Į, IL-1ȕ e IL-6. A citocina TNF-Į é também conhecida como sendo o gatilho para liberação de outras citocinas pró-inflamatórias, como a IL-1ȕ (43, 61). Além disso, a potência da TNF-Į na indução da ativação de neutrófilos é muito maior que a de outras citocinas (62). No presente experimento, sua imunomarcação é intensa nos rins dos animais dos dois
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grupos experimentais. Contudo, os animais de G2 apresentaram menos degeneração e necrose que os animais de G1. Ou seja, não é provável que o TNF-Į seja a citocina implicada nesta diferença de comportamento.
Neste estudo, os valores sangüíneos de TNF-Į, que já estavam elevados em M1, em G1 e G2, porém muito mais neste último grupo, continuaram a aumentar até M3 de G1, mas diminuíram em M3 de G2, embora ainda permanecendo elevados em relação ao normal. Os valores de IL-1 estavam aumentados apenas em M1 de G2 porque em M1 de G1 ainda eram normais, mas também se elevaram em seu M3, enquanto que diminuíram em M3 de G2. Ao final do experimento, 110 minutos desde que a dissecção no pescoço dos animais se completara, os resultados das duas citocinas eram altos em ambos os grupos, em relação ao normal, porém eram muito mais altos em G1. A meia- vida do cetoprofeno é de 1,8 ± 0,4 h (63), portanto, em M3, a ação deste AINE já teria declinado em algum grau (não se pode esquecer, porém, que, na situação de hemorragia sem ressuscitação, estaria diminuída a depuração plasmática do cetoprofeno) e a produção de prostaglandinas já estaria sendo restaurada no organismo e a inibição de citocinas estaria ocorrendo em G2. Em G1, os acontecimentos seguiram outros caminhos, uma vez que não recebeu antiinflamatório.
Peng et al. (64) pesquisaram as alterações fisiológicas durante choque hemorrágico cumulativo em ratos conscientes, comparando-as com as de ratos anestesiados com pentobarbital sódico administrado por via venosa. Estes sofreram perda volêmica igual à dos animais deste presente estudo, ou seja, 30%. Os autores estudaram as concentrações de TNF-Į e IL-1ȕ quando da hemorragia e não encontraram alterações destas citocinas no plasma dos animais anestesiados, tendo as mesmas se elevado nos ratos conscientes. A pressão arterial neste grupo com anestesia também foi diferente, sendo significativamente mais baixa que a dos grupos que permaneceram conscientes. A inserção de cateteres nos animais para a retirada de sangue foi realizada no dia anterior ao do experimento, de tal modo que, no dia do experimento, nenhuma instrumentação cirúrgica ocorreu, ou seja, não houve estímulo para maior produção de citocinas pró-inflamatórias, além da hemorragia.
Por outro lado, os animais de G1 apresentaram hipotensão significativa, mas este fato não ocorreu com os animais de G2, nos quais foi observada diminuição biológica da pressão arterial média, porém sem significância estatística. A primeira conseqüência
desta diferença de comportamento entre os grupos seria a suposição de que os melhores resultados histológicos observados em G2 poderiam ser decorrentes deste fato. Ocorre que no estudo de Silva et al. (23), cujo modelo é idêntico ao desta atual pesquisa, não houve diferença significativa entre as hipotensões arteriais observadas em ambos os grupos e, ainda assim, o grupo que recebeu o cetoprofeno também mostrou melhor resultado histológico.
Na detecção imuno-histoquímica renal das citocinas TNF-Į e IL-1, verifica-se que nos dois grupos há imunomarcação intensa de TNF-Į. Contudo, em G1, a imunomarcação também é intensa para IL-1 que, em G2, é de leve expressão em células tubulares e mesangiais glomerulares.
A IL-1 é o componente central de muitos processos inflamatórios agudos. O bloqueio do receptor IL-1 com um antagonista atenua a lesão por isquemia e reperfusão no cérebro, coração e fígado. Contudo, o papel da IL-1 na lesão renal por isquemia e reperfusão não é totalmente conhecido (22). Sabe-se que a ausência de receptor IL-1 não protege contra lesão renal de isquemia e reperfusão no camundongo KO (22). Neste presente estudo, sua expressão foi de leve intensidade em rins de animais que exibiram menos degeneração e necrose que os de animais controles, após episódios de hemorragia aguda, sugerindo que o cetoprofeno, além de inibir a produção de prostaglandinas, diminuiria a síntese de IL-1 pelas células tubulares e mesangiais glomerulares.
Sato et al. (65) estudaram, no rato, o papel do TNF-Į na disfunção renal após hemorragia leve (16,5% da volemia) sem ressuscitação fluídica. Para tanto, utilizaram o composto FR167653. Este antagoniza uma via de sinal intracelular com importante papel na expressão do mRNA de citocinas pró-inflamatórias, como TNF-Į e IL-1ȕ. Após uma hora de hemorragia, a expressão do mRNA de TNF-Į no rim e as concentrações séricas de TNF-Į estavam mais altas. O tratamento intraperitoneal prévio com FR167653 inibiu significativamente o aumento de TNF-Į. A infiltração de células inflamatórias e a lesão celular tubular, induzidas pela hemorragia, foram suprimidas e a disfunção renal foi dramaticamente reduzida no grupo que recebeu o tratamento com o referido composto. As alterações morfológicas também foram mais leves no grupo tratado, quando se comparou este ao grupo não tratado.
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Sato et al. (66) desenvolveram outro estudo em ratos para determinar o papel da proteína cinase ativada pelo mitógeno p38 (MAPK) na disfunção renal após choque hemorrágico. A MAPK é mediadora-chave em doenças que se caracterizam por inflamação e tem papel importante na via de sinalização intracelular, sendo ativada em situações de isquemia. A sua ativação promove respostas de estresse celular, como proliferação, diferenciação e produção de citocinas pró-inflamatórias. Os autores demonstraram que a p38 MAPK renal foi ativada em choque hemorrágico, tendo promovido a expressão de citocinas pró-inflamatórias no rim e, como conseqüência, desenvolvido disfunção renal. Esta cinase seria, então, essencial para que ocorresse lesão renal após choque hemorrágico.
A linha de células mesangiais dos vasos sangüíneos do glomérulo renal fornece- lhe suporte estrutural e regula a ultrafiltração glomerular (67). Estas células mesangiais expressam receptores de TNF-Į (68). Elas também apresentam alterações em seu fenótipo durante inflamação glomerular, tornando-se proliferativas, secretando miofibroblastos da matriz antes de serem eliminadas por apoptose (69). A apoptose foi identificada como o mecanismo responsável pelo desaparecimento de miofibroblastos em excesso na conclusão da resposta inflamatória no glomérulo renal (70). No glomérulo de pacientes com glomerulonefrite, foram detectados corpos apoptóticos como resposta compensatória, instigando a contrabalançar a hipercelularidade mesangial e, assim, permitindo que a estrutura e função normais retornassem (70).