A espécie radicalar oxigênio singlete (1O2) é responsável por maior parte dos
fotodanos em terapia fotodinâmica. Neste caso, a evidência quanto a fotoliberação dessa espécie no gel proposto é de grande importância.
A detecção de 1O2 gerado por fotoexcitação dos géis contendo o
fotossensibiliador ZnPC foi avaliada pelo método químico indireto usando 1,3- difenilsobenzenofurano (DPBF) como uma sonda química para o 1O
2 (TADA et al.,
2007). O DPBF reage irreversivelmente com o oxigênio singlete gerado pela
fotoexcitação de um fotossensibilizador e a reação pode ser acompanhada espectrofotometricamente através da obtenção do decaimento da intensidade de absorção do DPBF em 417 nm (CARLONI et al., 1993).
O sistema de irradiação utilizado na fotoestimulação foi um LED com emissão de luz em 630 nm construído pelo Prof. Dr. Iuri M. Pepe do LAPO-UFBA (Figura 25).
Figura 25. Imagem do LED com emissão em 630 nm.
Inicialmente, analisamos o comportamento fotofísico com o LED em uma solução de DPBF a fim de comprovarmos que o captador não interage com a luz no comprimento de onda de 630 nm (Figura 26 A). Foi feito também a mistura entre a solução de ZnPC e DPBF e observou-se que não há reação química entre as espécies (Figura 26 B).
400 500 600 700 800 0,0 0,2 0,4 0,6 0,8 1,0 Absorb ân cia Comprimento de onda (nm) 400 500 600 700 800 0,0 0,3 0,6 0,9 1,2 Absorb ân cia Comprimento de onda (nm)
Figura 26. Variação do perfil do espectro de absorção na região do UV-vis. da solução de DPBF em acetonitrila (tempo irradiação: 0, 300s, 600s e 900s) (A) e a mistura da solução de ZnPC (DMSO/DMF) em presença de DPBF (B) a temperatura ambiente (» 30 0C).
Em seguida, iniciou-se o teste qualitativo para liberação de 1O2 a partir da
ZnPC em meio homogêneo (DMSO/DMF, 1:1) e meio heterogênio (gel).
O espectro de absorção na região do UV/Visível do gel contendo ZnPC em meio homogêneo e DPBF se comportou como esperado, pois a medida que o gel é irradiado em função do tempo, o DPBF vai sendo consumido gradualmente, evidenciando assim que há liberação de oxigênio singlete por parte do fotossensibilizador (Figura 27).
400 500 600 700 800 0,0 0,5 1,0
Ab
so
rb
â
n
cia
Comprimento de onda (nm)
Figura 27. Espectro de absorção na região do UV/Vis do DPBF juntamente com a ZnPC (5 µmol L-1) em meio homogêneo. Tempo de irradiação: 0s (preto), 5s (vermelho), 10s (verde), 15s (azul escuro), 20s (azul claro) e 25s (rosa). As medidas foram realizadas a temperatura ambiente (» 30 0C).
O mesmo comportamento foi observado para a ZnPC incorporado ao gel PF- 127 (Figura 28).
400 500 600 700 800 0,0 0,5 1,0 1,5 2,0
Absorb
ân
cia
Comprimento de onda (nm)
Figura 28. Espectro de absorção na região do UV/Vis do DPBF juntamente com a ZnPC (5 µmol L-1) em meio heterogêneo. Tempo de irradiação: 0s (preto), 5s (vermelho), 10s (verde), 15s (azul escuro), 20s (azul claro) e 25s (rosa). As medidas foram realizadas a temperatura ambiente (» 30 0C).
Em ambos os sistemas homogêneo e heterogêneo foram possíveis verificar a diminuição da banda em 417 nm que evidencia a reação do DBPF com o oxigênio singlete. No entanto, é possível concluir que a saída de 1O2 é maior em meio
homogêneo que em meio heterogêneo (Figura 29), já a matriz gel altera o efeito da luz sobre a solução havendo espalhamento de luz e a solubilidade e difusão do oxigênio molecular também é alterada em relação ao meio homogêneo.
0 5 10 15 20 25 0,5 0,6 0,7 0,8 0,9 1,0
A
bs
orç
ão
l M À X=
417
nm
Tempo de irradiação (s)
Figura 29. Decaimento da absorção em 417 nm com tempo de irradiação para a ZnPC em meio homogêneo (·) e meio heterogêneo (·).
4.9. ESTUDO DE DETECÇÃO DE NO
A fotólise do complexo [Ru(NH.NHq)(tpy)NO]3+ nas formulações em gel contendo [Ru(NH.NHq)(tpy)NO]3+ e [Ru(NH.NHq)(tpy)NO]3+ + ZnPC foram realizadas usando um sensor de NO, que é um modo indubitável para provar a liberação de NO (SANTANA et al., 2010). O sinal gravado pelo sensor de NO gasoso aumenta rapidamente quando a fotólise é iniciada e diminui quando o feixe de luz é interrompido. O decréscimo de corrente se deve ao consumo de NO por vários caminhos, principalmente a oxidação (DE LIMA, 2006). As figuras 30 e 31 mostram o cronoamperograma de liberação de NO a partir dos géis [Ru(NH.NHq)(tpy)NO]3+ e [Ru(NH.NHq)(tpy)NO]3+ + ZnPC, respectivamente.
Figura 30. Cronoamperograma para o gel contendo o complexo [Ru(NH.NHq)(tpy)NO]3+ sob irradiação de laser em 470 nm. As medidas foram realizadas a temperatura ambiente (» 30 0C).
Figura 31. Cronoamperograma para o gel contendo os dois complexos, [Ru(NH.NHq)(tpy)NO]3+ e ZnPC, sob irradiação de laser em 670 nm. As medidas foram realizadas a temperatura ambiente (» 30 0C).
Como pode ser visto nas Figuras 30 e 31, a presença de corrente é uma prova direta da liberação de NO a partir dos géis de PF-127 quando foram irradiados como descrito anteriormente.
O mecanismo de liberação de NO a partir do gel contendo associação dos dois complexos metálicos, [Ru(NH.NHq)(tpy)NO]3+ e ZnPC + [Ru(NH.NHq)(tpy)NO]3+, são diferentes. A saída de NO pelo complexo [Ru(NH.NHq)(tpy)NO]3+ quando irradiado em 470 nm se deve a transferência de elétron do ligante NH.NHq e redução do RuII-NO+ (DE LIMA et al. 2006)
Já a fotoexcitação em 670 nm para o sistema ZnPC + [Ru(NH.NHq)(tpy)NO]3+ há liberação de NO, pois conforme mecanismo citado anteriormente por MARANHO e colaboradores (2009), a ZnPC no estado excitado singlete tem potencial redox suficiente para reduzir o RuII-NO+ e promover a liberação de NO0.
Ambos experimentos acima, após a liberação de NO o fotoproduto formado é complexo [RuII(H2O)(terpy)(NH.NHq)]+2 (Figura 32). A absorção em 480 nm é
indicada pela transmissão da cor vermelha evidenciada da Figura 33, após irradiação com laser no gel incorporado com complexo [Ru(NH.NHq)(tpy)NO]3+.
300 400 500 600 0,0 0,5 1,0
A
bs
orbâ
nc
ia
Comprimento de onda (nm)
Figura 32. Espectro na região do UV/Vis para o complexo [Ru(H2O)(tpy)(NH.NHq](PF6)2 em meio aquoso [complexo]=4x10-5 mol.L-1.
Figura 33. Gel de PF-127 contendo o complexo [Ru(tpy)(NH.NHq)NO]3+, após irradiação em 470 nm. Tom de rosa mais escuro é atribuído ao complexo [RuII(H2O)(tpy)(NH.NHq)]+2 e o tom de rosa mais claro ao complexo
[Ru(NH.NHq)(tpy)NO]3+.
Os resultados encontrados para esse experimento de fotólise do complexo [Ru(NH.NHq)(tpy)NO]3+ e a posterior liberação de NO está de acordo com o trabalho desenvolvido por SHISHIDO e colaboradores (2003), no qual foi desenvolvida uma formulação a base géis de PF-127 e nela foi incorporada a S-nitrotrosoglutationa e a S-nitroso-N-acetilcisteína, que são compostos que agem como reservatório de NO in
vivo e liberam-no seletivamente quando irradiados em comprimentos de onda no
valor de 545 nm. Como era esperado, após a irradiação dos géis de PF-127 houve a
NO meter
tampão
liberação seletiva de NO para ambas as formulações, pois como os géis de PF-127 são transparentes, eles permitem a irradiação dos compostos incorporados para propostas fototerapêuticas (SHISHIDO et al., 2003).
4.10. POTENCIAL ZETA
Potencial zeta (ζ) é uma importante característica das partículas poliméricas que reflete o potencial de superfície das partículas (SCHAFFAZICK et al., 2003). Para partículas pequenas em meio liquido, não existe uma técnica satisfatória para se determinar a sua carga da superfície. A prática comum é determinar o potencial elétrico da partícula em um local diferente da superfície, na camada difusa. Essa localização relacionada ao movimento da partícula no líquido é chamada de superfície de cisalhamento, e o potencial medido nesse plano é chamado de potencial zeta (SOARES, 2009).
O potencial zeta não pode ser medido diretamente, então se usa algum tipo de medida indireta, a partir do qual se calcula o potencial zeta. A técnica mais usada e mais aceita é através da mobilidade eletroforética, no qual se introduz o material a ser analisado diluído em uma cuba com dois eletrodos e aplica-se um potencial elétrico a este. As partículas com carga elétrica líquida movimentarão em direção ao eletrodo de carga contraria, tão mais rapidamente quanto maior for sua carga elétrica e maior o campo elétrico aplicado (PELEGRINO, 2007).
A determinação do potencial zeta é relevante por diversos motivos, sendo muito útil para obtenção de informações como a estabilidade da formulação e o tipo de interação entre a substância ativa e o carreador. (BARRAT, 1999; HAAS, 2007, SOARES, 2009).
Os valores de potencial zeta para o gel de PF-127 vazio (controle) e incorporados com complexos metálicos estão relatados na Tabela 3.
Tabela 3. Valores de potencial zeta obtidos para as preparações em géis de PF-127.
Formulação Potencial Zeta (mV)
Gel vazio -16,6
[Ru(tpy)(NH.NHq)NO]3+ -12,4
ZnPC -24,1
[Ru(tpy)(NH.NHq)NO]3+ + ZnPC -34,0
Os potenciais zeta para as preparações em gel PF-127 vazio e na presença dos complexos metálicos foram analisados e as preparações apresentaram potencial zeta negativo, o que está de acordo com os trabalhos realizado por SEZGIN e colaboradores (2006) e BASU e BANDYPADHYAY (2010). LIU et al. (2011), também encontraram valores negativos para outro tipo de poloxamer em tampão fosfato, o P123.
Com os valores da Tabela 3, é possível observar que a os complexos metálicos afetam o potencial zeta em relação ao gel controle. Na formulação que contem o complexo [Ru(tpy)(NH.NHq)NO]3+, apresentou um aumento do valor de
potencial zeta em relação ao gel controle, isto pode ser justificado pelo fato que o complexo nitrosilo de rutênio apresentar carga positiva em solução.
No caso das preparações que contem a ZnPC, a alteração foi mais negativa em comparação ao gel vazio. Tendo em vista, que o composto de ZnPC é hidrofóbico, acredita-se que sua localização na micela polimérica seja na região interna da mesma, onde na proporção de 20% m/m os grupamentos OP do copolímero tribloco encontram-se orientados na região interna da micela normal. Com a incorporação da ZnPC na fase interna da micela os grupos pendentes OE tendem a se orientar na superfície da micela tornando-a mais negativa que a superfície do gel controle (DING; WANG; GUO, 2004).
4.11. ANÁLISE DO TAMANHO DE PARTÍCULA
O PF-127 é um copolímero em bloco que tem a propriedade de formar micelas em soluções aquosas. O tamanho dessas micelas é um parâmetro importante do ponto de vista da liberação de fármacos, pois pode afetar fortemente a circulação no sangue e a biodisponibilidade das partículas dentro do corpo (KABANOV; BATRAKOVA; ALAKHOV, 2002). Então, para se determinar o tamanho médio das partículas obtidas nas diferentes formulações, foram realizadas medidas de espalhamento dinâmico de luz (em inglês, DLS - Dynamic Light Scattering).
Utilizando-se de determinadas propriedades da luz, é possível obter informações a respeito do tamanho médio de partículas em dispersão. O espalhamento dinâmico da luz é uma técnica bem conhecida para se determinar a distribuição de tamanho de partículas com diâmetros variando entre poucos nanômetros até micrometros. Nesta técnica, um feixe de laser incide sobre uma dispersão contendo partículas esféricas em movimento browniano, causando um efeito semelhante ao efeito Doppler quando a luz incide nas partículas em movimento, mudando o comprimento de onda da luz. Esta mudança está diretamente relacionada ao tamanho das partículas, ou seja, partículas menores causam maiores variações no comprimento de onda da luz, uma vez que possuem maior velocidade média do que as partículas maiores. Dessa maneira, é possível estimar a distribuição de tamanho das partículas através da descrição do seu movimento no meio, medindo o coeficiente de difusão das partículas e usando uma função de autocorrelação (CASTRO, 2009).
As medidas de distribuição de tamanho para as formulações (Tabela 4) foram realizadas em diferentes temperaturas, a fim de se avaliar o comportamento do gel termossensivel.
Tabela 4. Distribuição de tamanhos das formulações com gel PF-127. Tamanho nm (%)/PDI 10 0C 15 0C 20 0C 25 0C 35 0C Gel vazio 5,49 (91)/0,172 5,73 (93)/0,242 6,54 (79)/0,486 37,4 (54) e 6,59 (46)/0,455 24,88 (100)/0,146 Gel ZnPC 5,80 (62)/0,309 5,80 (73)/0,259 6,76 (64)/0,310 29,0 (23) e 5,29 (77)/0,658 25,63 (100)/0,183
PDI= índice de polidispersividade
Os dados de espalhamento de luz indicam que a partir de 25 0C é possível verificar a formação de micelas, com tamanho de 37,4 nm e 29,0 nm para gel vazio (controle) e ZnPC respectivamente. Anterior a esta temperatura foi possível observar a presença de unímeros (com tamanho na faixa de 5,5 a 6,8 nm) e agregados de unímeros (alta polidispersividade) (BONACUCINA et al., 2007). Os perfis monodispersão foram obtidos somente a 35 0C, onde 100 % das espécies em solução são micelas e trata-se de uma preparação homogênea tendo em vista a baixa polidispersividade (Figura 34).
Figura 34. . Distribuição de partícula para a preparação do gel PF-127 com ZnPC a 35 0C.
5.CONCLUSÕES
O desenvolvimento das formulações à base de géis de Pluronic® F127 mostrou-se satisfatório para a incorporação de complexos metálicos do tipo ZnPC e [Ru(NH.NHq)(tpy)NO]3+. Através de técnicas espectroscópicas como as de absorção de radiação eletromagnética na região do UV/Vis e de emissão de fluorescência, foi possível verificar que estes complexos se comportaram de modo semelhante a quando estão em meio homogêneo, sem alteração de suas características espectrais.
As análises por espectroscopia na região do infravermelho demonstraram que os géis de PF-127, quando incorporados com os complexos, possuíam o mesmo perfil espectral do controle (gel apenas com o PF-127), confirmando que não houve nenhuma reação química entre o veículo e os princípios ativos, sendo provavelmente uma interação física nesta formulação.
Os estudos de estabilidade revelaram que as formulações desenvolvidas neste trabalho permaneceram estáveis durante 28 dias de armazenamento, sem alteração das características dos complexos metálicos ZnPC e [Ru(NH.NHq)(tpy)NO]3+.
As análises por difração de Raios-X mostraram que a adição dos complexos ZnPC e [Ru(NH.NHq)(tpy)NO]3+ não afetam a cristalinidade das formulações liofilizadas, sendo semelhantes a formulação controle. O processo de liofilização foi necessário, pois foi feita uma análise da forma gel e foi verificado que nesta havia a perda da cristalinidade da formulação. Este dado é mais um indicativo de que os complexos não reagem quimicamente com PF-127.
Morfologicamente as formulações tinham um aspecto homogêneo, poroso e lamelar. O íon metálico Ru(II) parece possuir maior influência sobre a morfologia do material, pois quando ele foi adicionado houve uma diminuição da porosidade e das lamelas.
As formulações apresentaram um potencial zeta com valor negativo. Em relação à formulação controle, a formulação contendo o complexo [Ru(NH.NHq)(tpy)NO]3+ teve um aumento no valor desse potencial e as formulações contendo ZnPC apresentaram um valor mais negativo.
As formulações a base de géis de Pluronic® F127 foram capazes de gerar espécies reativas de oxigênio (1O2) e espécies reativas de nitrogênio (NO), após
irradiação luminosa, a partir dos complexos ZnPC e [Ru(NH.NHq)(tpy)NO]3+, respectivamente.
Portanto, as formulações a base de géis de Pluronic® F127demonstram ser sistemas de liberação adequados para a incorporação de complexos metálicos de diferentes polaridades, ZnPC e [Ru(NH.NHq)(tpy)NO]3+, não afetando as suas características físico-químicas e liberando seletivamente o 1O
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