Detecção e c a ract e ri za ção de bla S H

E m 100% da s cep as d e K. pneu moniae su bmet ida s à a ná lis e po r PCR par a a ide nt ific aç ão d e blaS H V fo i a mp lific ado u m frag me nt o de 861p b,

co rrespo nde nt e à r eg ião co d ific ado ra do ge ne. Esse resu lt ado co nfir ma a ubiq u idad e de blaS H V e m K. pne umonia e (Ba bin i e Liver mo re, 2000).

A figura 2 mo st ra a a mp lific aç ão po r PCR de blaS H V do s

iso lado s c lín ico s de K. pn eumoni ae e st udado s. O seqüe nc ia me nt o do s gene s a mp lific ado s po r PCR mo st ro u a prese nç a de blaS H V - 1, blaS H V - 2, blaS H V - 2 a,

blaS H V - 5, blaS H V - 1 1, blaS H V - 1 2, blaS H V - 2 5 , blaS H V - 3 1 , blaS H V - 3 8, blaS H V - 6 2 e

blaS H V - 1 0 8. Os ge ne s blaS H V a mp lific ado s a pa rt ir de set e iso lado s (HB -07,

HB-30, H B-36, HB-41, HB-53, H B-5 4 e H B-75) não pud era m ser seqü e nc ia do s.

Ap esar de SHV -1 ser a bet a - lact a ma se ma is co mu me nt e e nco nt rada e m K. pneu monia e (Brad fo rd, 2001), est ando prese nt e e m c erc a de 90% do s iso lad o s c lín ico s (Liver mo r e, 1995), ne st e est udo , blaS H V - 1 fo i

o segu ndo ge ne ma is a bu nd a nt e, se ndo e nco nt rado e m apro xima da me nt e 33% da s a mo st ras t est ada s (31/94). O ge ne ma is a bu nda nt e, blaS H V - 1 1, qu e é

u ma var ia nt e d e blaS H V - 1, fo i id e nt ific ad o e m apro xima da me nt e 35% da s

Fi g ur a 2 : Gel d e a g a r ose c on t en d o fr a g m en t os d o g en e b l aS H V a m p l i fi ca d os p or PC R d e cep a s K . p n e u mo n i a e . M – Mar ca d or ( La d d er 10 0 ) . Am ost r a s d e K . p n e u mo n i ae ; C N – C on t r ol e n eg a t i vo. A set a i n d i ca u m fr a g m en t o d e 8 6 1 p b, c or r esp on d en t e a r eg i ã o c od i fi ca d or a d o g en e b l aS H V.

a mo st ras (33/9 4). SHV -11 s e d ifere nc ia de SHV -1 po r ape nas u ma su bst it u iç ão de leu c ina po r g lut a mina na po s iç ão 35 (Nüe sc h -I nd er bine n, 1997). De lo ca liz a ção cro mo ssô mic a e m K. pneu monia e (Lee et al., 20 06), blaS H V - 1 e blaS H V - 1 1, co d ific a m bet a- lact a ma se s de esp ect ro rest rit o (Mo rris

et al., 2003).

Ent re o s 33 iso lado s no s qua is fo ra m id e nt ific ado s bl aS H V - 1 1,

21 apre se nt a va m o ut ro gene d e re s ist ê nc ia para ce fa lo spo r inas ( b laC T X - M).

E m 20 do s 31 iso lado s no s qu a is fo ra m ide nt ific ado s blaS H V - 1, blaC T X - M

t ambé m fo i e nco nt rado , o que e xp lic a o fe nó t ipo de re s ist ê nc ia apre se nt ado po r est es iso lado s, inc lus ive a res ist ê nc ia a ce fo t axima.

Ent re o s 20 iso la do s que apre se nt ara m ap e na s g e ne s det er mina nt e s para bet a - la ct a mas es d e espe ct ro rest rit o , co mo blaS H V - 1,

blaS H V - 1 1 e blaT E M - 1, o it o fo ra m se nsíve is a to das a s ce fa lo spo r inas t est ada s.

Ent ret ant o , do ze aprese nt ara m re sist ê nc ia a pe lo me no s u ma da s ce fa lo spo r ina s de t erce ira gera ção e resu lt a do po sit ivo no t est e fe no t íp ico para a det ec ção da pro d ução de ESB L. Nest es ca so s, o s mét o do s usa do s para a det ecção do s ge nes bl a det er mina nt es par a a res ist ê nc ia po de m não t er s ido su fic ie nt e me nt e s e nsíve is, o u a res ist ê nc ia po de ser d et er mina da po r o utro s meca nis mo s qu e não fo ra m o bjet o dest e est udo, co mo a perda d e po rinas e e xpressão de bo mba s de e flu xo (N ik a ido , 2009).

O ge ne blaS H V - 1 2, de lo ca liz aç ão p las mid ia l e m K. pneum oniae ,

que co d ific a a pro dução de u ma ESBL ( Lee et al., 2006) fo i ide nt ific ado e m 11% do s iso lado s t est ado s (10/94), sendo o t ipo de blaS H V a sso c iado a

pro dução de ESBL ma is pre va le nt e e nt re as cepa s de K. pneu monia e est udada s. De aco rdo M ir ia go u e co la bo radores (2006), SH V -12 co nfer e a lt o s níve is de res ist ê nc ia co nt ra a ce ft az id ima. Est a e nz ima e nco nt ra -se d isse mina da na Ásia ( Hawk e y, 2008), Euro pa (Cant o n et al., 2008) e Est ado s U nido s (B ush et a l., 200 8), t endo sido t a mbé m iso lada na Amér ic a do Sul (Pa lle c hi et al., 2007). Em no sso co nhec ime nt o , est e é o prime iro re lat o de sua o co rrênc ia no Bra s il. E nt re o s dez iso la do s que apre se nt ara m blaS H V - 1 2, o it o aprese nt a m a lt o s va lo re s d e CI M p ara a ce ft a z id ima, a lé m d e

ce fo t axima e ce ft r ia xo na. Se is iso lado s (HB -03, HB-0 4, HB-19, H B-21, HB-24, HB-32) c arre ia m t a mbé m blaC T X - M, que t a mbé m d et er mina m a

cepa s qu e apr es e nt a m co mo det er mina nt e para a pro dução de ESB L a pe na s blaS H V - 1 2 apre se nt ara m r es u lt ado po s it ivo no t est e fe no t íp ico co nfir mat ó rio

para a pro dução de ESBL.

O ge ne bl aS H V - 2 fo i ide nt ific ado e m do is iso lado s (HB -44 e

HB-70). SHV-2 fo i a pr ime ira ESB L d escr it a ( Kno t he et al., 1983), e e nco nt ra-se d is s e mina da mu nd ia lme nt e (Her it age et al., 1999). SHV -2 d ifer e nc ia- se d e SHV-1 po r ape na s u ma su bst it u iç ão de g lic ina po r ser in a na po s iç ão 238. Iso lado s c lín ico s a prese nt a ndo SHV-2 apre se nt a m resist ê nc ia a to das as ce fa lo spo r ina s de a mp lo e spe ct ro e ao azt reo na m (Jaco b y e C arrera s, 1990), e de aco rdo co m Hu let sk y e co la bo rado res (1993), u ma ma io r a fin idad e po r ce fo t axima e ce ft a z id ima dura nt e a hidró lis e. As cepa s HB -4 4 e HB-70 o nde blaS H V - 2 fo i e nco nt rado

apres e nt ara m re s ist ê nc ia a c e ft r ia xo na , ce fo t axima e c e ft az id ima e resu lt a do po sit ivo no t est e fe no t íp ico co nfir mat ó r io para a pro dução de ESBL.

O ge ne blaS H V - 2 a fo i ide nt ific ado e m d o is iso lado s c lín ico s

(HB-34 e HB-56). A e nz ima co d ific a da po r est e ge ne fo i de scr it a in ic ia lme nt e e m 19 91 (Po dbie ls k i et al., 1991a). Apre se nt a e le va da capa c idad e hidro lít ica so bre a ce fo t a xima , pro vo cada po r u ma a lt era ção na reg ião do pro mo t or dest e ge ne var ia nt e (Po dbie lsk i e t al., 1991 b). Assi m co mo blaS H V - 2, blaS H V - 2 a e nco nt ra-se d isse mina da mu nd ia lme nt e

(Cha na wo ng et al., 2001 ; Iko no mid is et a l., 2007). No t est e de d ilu ição e m ágar, HB-3 4 apre se nt o u se nsib ilid ade à ce ft a z id ima ( MIC = 8) e re sist ê nc ia int er med iár ia à ce ft r ia xo na (MI C = 3 2) e ce fo t axima ( MIC = 16). Ent ret ant o , o t est e fe no t íp ico co nfir mat ó rio ind ico u a pro dução de ESBL, e o t est e de se ns ib ilid ade at ravé s d e met odo lo g ia a ut o mat izad a ind ico u qu e HB-34 é re sist e nt e ao s t rês a nt ibió t ico s a c ima me nc io nado s. A cep a H B -56 apres e nt o u res ist ênc ia a c e ft r ia xo na, ce fot axima e c e ft az id ima e re su lt ado po sit ivo no t est e fe no t íp ico co nfir mat ó rio para a pro dução de ESBL.

E m do is iso lado s (H B -77 e HB-78) fo i e nco nt rado o gene blaS H V - 3 8, der ivado de blaS H V - 1. Est e ge ne, de lo ca liz ação cr o mo s sô mic a,

co d ifica a pro duç ão de u ma e nz ima qu e apre se nt a u ma su bst it u iç ão da a la nina po r u ma va lina na po siç ão 146. Est a enz ima fo i d escr it a co mo a únic a SHV cro mo ssô mica co m at ivid ade hidro lít ic a so bre u ma

ce fa lo spo r ina de es pect ro est end ido , a ce ft az i d ima (Po ire l et al., 2003). O s iso lado s apre se nt a ndo blaS H V - 3 8 apre se nt ara m res ist ê nc ia a c e ft az id ima, a

ce fo t axima e ce ft r ia xo na, co m e le vado s va lo re s de CI M, o que po de ser e xp lica do pe la pres e nç a co nco mit a nt e de ge ne s blaC T X - M. Não fo i o bser vad a

res ist ê nc ia ao imipe ne n ne st as cep as, apes ar de est a e nz ima t er s ido t ambé m de scr it a co mo a ú n ica SH V co m at ivid ade ad ic io na l d e car bap e na ma se (Po ire l et al., 2003). A id e nt ific a ção dest e ge ne no Bra sil é descr it a aqu i p e la pr ime ir a ve z, e su a prese nça a le rt a pa ra o r isco d a e mergê nc ia d e res ist ê nc ia ao imip e ne m me d iad a po r SHV, a mp la me nt e ut iliz ad a para o trat ame nt o de infec çõ es p o r cepas pro duto ras de ESBL.

O ge ne blaS H V - 5 fo i e nco nt rado e m u m iso la do , no qua l t a mbé m

fo i id e nt ific ado u m ge ne blaC T X - M. Est a cep a (H B-92) a pres e nt o u

res ist ê nc ia a ce ft r ia xo na, ce fo t a xima e ce ft az id ima. A e nz ima SH V -5, descr it a po r B illo t -Kle in e co la bo rado res (1990) é u ma ESB L der iva da d e SHV-4. Apre se nt a d is se minaç ão mu nd ia l, t endo s ido previa me nt e de scr it a no Bras il (G arc ia et al., 2008).

Ta mbé m fo ra m e nco nt rado s o s genes blaS H V - 1 0 8 , blaS H V - 6 2 ,

blaS H V - 2 5 e blaS H V - 3 1, e m u m iso lado cada.

O ge ne blaS H V - 1 0 8 fo i rec e nt e me nt e descr ito em Po rt uga l, t endo

s ido ide nt ific ado exc lu s iva me nt e e m u ma cepa de K. pneu moniae iso lad a dura nt e u m est udo de v ig ilâ nc ia d a res ist ê nc ia med iada po r ESBL rea liz ado e m vár io s ho sp it a is do pa ís ( Me ndo nça et . al., 2009). Ent ret anto , devido a prese nça co nco mit a nt e de blaC T X - M - 1 5 e blaT E M - 1 0 na c epa c arreado ra de

blaS H V - 1 0 8 , não fo i po ss íve l det er minar s e est a e nz ima det er mina a pro dução

de u ma ESBL. No Bras il, est e é o pr ime ir o re lat o da det ecção de st e ge ne, e dura nt e no s so est udo blaS H V - 1 0 8 fo i ú nico gene det ect ado na ce pa e m

quest ão . Os t est es de se ns ib ilid ad e po r d ilu iç ão e m ágar e po r met o do lo g ia aut o mat izada ind ic ara m qu e e st a cep a é se nsíve l à s c e fa lo spo r inas d e t erce ira ger ação e não é pro duto ra de ESBL. Se ndo assim, de a co rdo co m o s dado s o bt ido s, suger imo s que blaS H V - 1 0 8 não det ermine a pro dução de

ESBL.

Não fo i e nco nt rado na lit erat ura info r maçõ es so br e a e nz ima SHV-62. Os ú nico s da do s d ispo n íve is são as se quê nc ia s de a mino ác ido s, e

do s nuc leo t íd eo s do gene bl a co rrespo nd e nt e, d ispo níve l no Ge nB a nk, co m a qua l a no ssa sequ ê nc ia fo i co mparad a e aprese nt o u 100% de similar id ade.

A e nz ima SHV -25, u ma bet a- lact a ma se de espect ro rest rit o , fo i re lat ada pe la pr ime ir a ve z e m T a iwa n ( C ha ng et. al., 20 01). Re ce nt e me nt e, fo i det ect ada e m u ma t rês cep as de K. pneumoni ae iso lad as dur a nt e u m est udo para a a va lia ção da pre va lê nc ia de e nt ero bact ér ias re s ist e nt es a a mp ic ilina e m u ma var ie dad e de qu e ijo e g íp c io (H a mmad et a l., 2009). E m no s so est udo , a cepa carrea do ra de blaS H V - 2 5 (H B-31) apre se nt o u

res ist ê nc ia à ce ft a z id ima ( CIM=2 56), ce fot axima ( CIM= 128) e c e ft r ia xo na (CIM=64), e fo i co nfir mad a co mo pro duto ra de ES B L, o que suger e a o corrênc ia de o ut ro s meca nis mo s d e re sis t ênc ia que não t enha m sido a lvo s dest e est udo o u passíve is d e det ecção pe lo s mét o do s ut iliz ado s.

O ge ne blaS H V - 3 1 , de scr it o pe la pr ime ir a ve z e m 2007, na

Ho la nd a, co d ific a u ma bet a - la ct a mase de e spe ct ro ext end ido ( Maz zar io l et. al., 2007). E m no s so est udo , a cepa HB -63, c arreado ra de blaS H V - 3 1

aprese nt o u resist ê nc ia int er med iár ia à c e ft az id ima e à ce fo t a xima, mas fo i id e nt ifica da co mo pro dut o ra de ESBL pe lo t est e fe no t íp ico co nfir mat ó rio . Não fo i det ect ado ne nhu m o ut ro gene co dific ado r de ESBL nest a c epa. E m no sso co nhec ime nt o , est e é o prime iro re lat o de blaS H V - 3 1 no Bras il.