Para a realização dos testes antimicrobianos do óleo essencial de Croton blanchetianus Baill foram realizadas as metodologias de difusão em placas (screening), Concentração Inibitória Mínima (CIM), Concentração Bactericida Mínima (CBM), Viabilidade bacteriana e aplicação do óleo essencial em alimento.
3.6.1 Estirpes bacterianas
As estirpes utilizadas como micro-organismos teste nos ensaios antimicrobianos foram: Aeromonas hydrophila INCQS 7966, Escherichia coli ATCC 25922, Listeria monocytogenes ATCC 7644, Pseudomonas fluorescens ATCC 11253, Salmonella Enteritidis CDC 49812 e Staphylococcus aureus ATCC 6538, as quais foram obtidas através da coleção de micro-organismos de referência do Instituto Nacional de Controle de Qualidade (INCQS) da Fundação Oswaldo Cruz (FIOCRUZ) do Rio de Janeiro, Brasil. Os inóculos utilizados nos ensaios antimicrobianos foram obtidos de culturas dos micro-organismos cultivadas em Ágar Mueller Hinton a 28 ºC para A. hydrophila e P. fluorescens e a 37 ºC para os demais micro-
organismos, por aproximadamente 18 horas. Uma alíquota de cada cultura foi tomada com o auxílio de uma alça bacteriológica e diluída em solução salina (0,85 g.100mL-1) esterilizada, sendo em seguida, a turvação da suspensão obtida ajustada a turbidez do tubo 0,5 da escala de McFarland, representando um inóculo aproximado de 108 Unidades Formadoras de Colônias por mL (UFC.mL-1) (FROMTLING et al., 1983; DRUTZ, 1987; BELÉM, 2001).
3.6.2 Difusão em Placas (screening)
Nesse teste prévio da ação antimicrobiana do óleo essencial de marmeleiro, foram testadas as estirpes de Aeromonas hydrophila, Escherichia coli, Listeria monocytogenes, Pseudomonas fluorescens, Salmonella Enteritidis e Staphylococcus aureus que são micro- organismos de interesse em alimentos, de acordo com a metodologia modificada do Clinical and Laboratory Standards Institute (CLSI, antigo National Committee for Clinical Laboratory Standards, NCCLS) M2-A8, utilizando-se 100 µL de suspensão dos micro-organismos, contendo cerca de 108 UFC.mL-1 para inocular as placas. Na realização dos testes foram utilizados discos de papel Watmann número 3, com 6 mm de diâmetro, que foram colocados sobre o meio de cultura Ágar Mueller Hinton. Para cada micro-organismo, um volume correspondente a 20 µL do óleo foi testado em cada disco, no final do período de incubação foi considerado como atividade antimicrobiana positiva quando observado a formação de halo de inibição do crescimento microbiano com diâmetro igual ou superior a 10 mm (SOUZA et al., 2005). Os testes foram realizados em triplicata, e os antibióticos penicilina (10 μg/mL) e neomicina (10 μg/mL) foram utilizados como referência para as bactérias.
3.6.3 Determinação da Concentração Inibitória Mínima (CIM) e Concentração Bactericida Mínima (CBM)
A CIM do óleo essencial de marmeleiro, frente a cada estirpe teste, foi determinada através da técnica de macrodiluição em caldo. Para tal, foram preparados tubos de ensaio contendo 5 mL de Caldo Mueller Hinton duplamente concentrado adicionados de 0,15 g.100mL-1 de ágar bacteriológico e suplementados com 4 mL das diferentes concentrações
dos antimicrobianos. Em seguida, foi adicionado de 1 mL do inóculo das bactérias teste, sendo o sistema incubado a 35-37 °C por 24 horas. Ao término do período de incubação, a mais baixa concentração (maior diluição) do antimicrobiano que não apresentou crescimento microbiano visível (turvação) foi considerada como a CIM. Após esta observação, alíquotas de 100 µL dos tubos que não apresentaram crescimento microbiano visível, foram inoculadas em tubos de ensaio contendo Ágar Mueller Hinton inclinado, por 24-48 horas a 37 °C. A CBM foi considerada como a menor concentração, na qual a bactéria teste não apresentou capacidade de crescimento em Caldo Mueller Hinton adicionado do óleo essencial, bem como não foi capaz de crescer quando inoculadas em Ágar Mueller Hinton. Como ensaios controle, foram utilizados sistemas sem adição de antimicrobianos (FU et al., 2007).
3.6.4 Influência do óleo essencial sobre a cinética microbiana
O estudo de interferência dos óleos essenciais sobre a cinética de crescimento microbiano foi realizado através do método de contagem de células viáveis, com as estirpes que apresentaram perfil de sensibilidade ao óleo essencial de marmeleiro no experimento da CIM e CBM. Para tanto foi observada a viabilidade das bactérias quando expostas a diferentes concentrações (CIM/2, CIM, CIM x 2) do óleo essencial testado por diferentes intervalos de tempo (0, 30, 60, 120, 240, 360, 480 e 600 minutos) a 37°C. Inicialmente, 1 mL da suspensão bacteriana foi inoculado em 4mL de Caldo Mueller Hinton com concentração ajustada para 10 mL, em seguida, foi adicionado 5 mL da solução do óleo essencial (2 x concentração desejada). O sistema foi incubado a 35-37 °C. Nos intervalos de 0, 30, 60, 120, 240, 360, 480 e 600 minutos pós-incubação, uma alíquota de 1,0 mL da suspensão foi diluída seriadamente (10-1 – 10-5)em água peptonada (0,1 g.100mL-1) esterilizada e uniformemente semeada em
placa de Petri contendo Ágar Mueller Hinton. No experimento controle, a solução do óleo essencial foi substituída por 5 mL de água destilada estéril. Após o fim do período de incubação, foi realizada a contagem do número de células viáveis, a qual foi expressa em log de UFC.mL-1 (BARROS et al., 2009).
3.6.5 Aplicação do óleo essencial em microsistema de conservação de alimento
Porções de carne bovina do tipo patinho, de alto teor protéico e baixo índice de gordura, foram cortados em cubos de 3 cm3 e acondicionados em Erlenmeyer com tampas, em seguida esterilizados em autoclave (121 ºC/15 minutos a 121 atm). Após a esterilização, as porções de carne foram inoculadas com uma suspensão microbiana de Listeria monocytogenes (micro-organismo que apresentou maior atividade antimicrobiana in vitro) de acordo com o seguinte procedimento: os pedaços de carne foram individualmente imersos em 50 mL do inóculo bacteriano (108 UFC.mL-1 preparado em solução salina estéril 0,85 g.100mL-1) e agitados com bastão de vidro estéril por 1 minuto com a finalidade de garantir uma inoculação homogênea. Posteriormente, os pedaços de carne foram aleatoriamente divididos em cinco grupos e imersos durante 30 segundos (1:4 p/v) em diferentes soluções: (I) controle - imerso em água destilada estéril; (II) imerso em solução contendo a CIM do óleo essencial; (III) imerso em solução contendo a CIM x 2 do óleo essencial; (IV) imerso em solução contendo a CIM x 5 do óleo essencial e (V) imerso em solução contendo a CIM x 10 do óleo essencial. As porções de carne foram acondicionadas em placas de Petri estéreis, seladas e armazenadas sob refrigeração (7 ºC ± 1 ºC). Nos período de 0, 24, 48, 72 e 96 horas de armazenamento, as amostras de carne foram submetidas a contagem UFC de Listeria monocytogenes de acordo com metodologia descrita por Oliveira et al. (2010). Os resultados foram realizados em triplicata e expressos em log de unidades formadoras de colônias por grama de carne (log UFC.g-1 de carne) como média dos três resultados paralelos.
3.6.6 Análises estatísticas
Os resultados foram analisados estatisticamente através de cálculos de média, desvio padrão, análise de variância e teste de Tukey com significância ao nível de 5% (p<0,05), utilizando o software STATISTICA versão 7.0 (Statsoft Inc, USA).
4 RESULTADOS
4.1 ARTIGO 1 - Composição química e atividade antibacteriana in vitro do óleo essencial das