Determinação da atividade antioxidante pelo método do DPPH

Diferentes concentrações de amostra (200 e 400 ppm), em metanol, foram misturadas com 5 mL de solução metanólica de DPPH 0,1 mM. O butilhidroxianisol (BHA) foi utilizado para comparação da atividade antioxidante. Para isso, BHA nas concentrações de 25 e 50 ppm foram misturados com 5 mL de solução metanólica de DPPH 0,1 mM. Os tubos foram agitados e a leitura foi realizada nos tempo 0 e 30 minutos. O controle foi preparado utilizando-se apenas a solução metanólica de DPPH 0,1 mM. O metanol foi utilizado como branco. As leituras foram realizadas em espectrofotômetro no comprimento de onda de 517 nm (Fig. 2.5). A porcentagem da atividade antioxidante foi calculada usando a fórmula: % AAT = (Abs controle – (Abs amostra/ Abs controle)) x 100 (SINGH, CHIDAMBARA MURTHY & JAYAPRAKASHA, 2002). Todas as determinações foram realizadas em quatro repetições.

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Figura 2.5: Esquema da determinação da atividade antioxidante pelo método do DPPH.

53 4. RESULTADOS E DISCUSSÃO

Através do cromatograma do extrato hidroalcoólico (condição 1), pode- se detectar a presença do flavonóide rutina (Fig. 2.6 e 2.7).

Figura 2.6: Cromatograma do extrato hidroalcoólico e do flavonóide rutina (condição 1) à 359,6 nm.

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Figura 2.7: Sobreposição dos cromatogramas do extrato hidroalcoólico e do flavonóide rutina (condição 1) à 359,6 nm.

No cromatograma da fração acetato de etila, obtido utilizando a condição 2, foi possível verificar a presença de picos com absorção UV nos comprimentos de onda entre 250 e 350 nm (Fig. 2.8). Essa faixa de absorção é característica de flavonóides (BELTRAME et al., 2001; VOIGT & BORNSCHEIN, 1979).

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Figura 2.8: Cromatograma da fração acetato de etila (condição 2) a 359,6 nm e espectros ultravioleta dos picos.

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Quando se comparou, nas mesmas condições experimentais, o cromatograma da fração acetato de etila com o do flavonóide rutina (Fig. 2.9), pode-se verificar, através do tempo de retenção (7,10 minutos) a presença da rutina na fração acetato de etila das folhas de C. verticillata verticillata.

A rutina possui várias atividades farmacológicas descritas, dentre elas, atividade hipoglicemiante, antibacteriana, antitumoral, antiinflamatória, antidiarréica, antiúlcera, antimutagênica, vasodilatadora e protetora do miocárdio (KAMALAKKANNAN & PRINCE, 2006).

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Figura 2.9: Sobreposiçao dos cromatogramas da fração acetato de etila de e do flavonóide rutina à 359,6 nm sobrepostos.

O resultado da quantificação de compostos fenólicos para EHA, FD e FA foram respectivamente 381,0, 52,0 e 2574,0 mg/mL em equivalentes de ácido tânico (Fig. 2.10). A equação da curva padrão de ácido tânico foi y = 0,002 + 0,060 e o R2 _{= 0,977.}

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Figura 2.10: Teor de compostos fenólicos expressos em equivalentes de ácido tânico do extrato hidroalcoólico (EHA), fração diclorometano (FD) e fração acetato de etila (FA).

Na fração acetato de etila (FA) da espécie C. verticillata verticillata a concentração de compostos fenólicos é significativamente maior do que no extrato hidroalcoólico e na fração clorofórmio (Fig. 2.10).

A espécie Acacia podalyriifolia que contém compostos fenólicos apresentou maior concentração destes compostos na fração acetato de etila (ANDRADE et al., 2007).

Estudos clínicos e epidemiológicos têm mostrado evidências de que antioxidantes fenólicos de cereais, frutas e vegetais são os principais fatores que contribuem para a baixa e significativa redução da incidência de doenças crônicas e degenerativas encontradas em populações cujas dietas são altas na ingestão desses alimentos. Desta forma, a importância da pesquisa por antioxidantes naturais tem aumentado muito nos últimos anos. Compostos típicos que possuem atividade antioxidante incluem a classe de fenóis, ácidos fenólicos e seus derivados, flavonóides, tocoferóis, fosfolipídios, aminoácidos,

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ácido fítico, ácido ascórbico, pigmentos e esteróis. Antioxidantes fenólicos são antioxidantes primários que agem como terminais para os radicais livres (ROESLER et al ., 2007).

Os resultados obtidos na determinação, pela metodologia do DPPH, da atividade antioxidante do extrato hidroalcoólico (EHA), da fração diclorometano (FD) e da fração acetato de etila (FA) estão dispostos na Tabela 2.4. O BHA foi utilizado como padrão.

Tabela 2.4: Porcentagem da atividade antioxidante pela metodologia do DPPH, do extrato hidroalcoólico (EHA), fração dicloro (FD), fração acetato (FA) e BHA.

AMOSTRAS (ppm)

TEMPO 30 min

MÉDIA ± DESVIO PADRÃO (α = 5%)

EHA (200) 6,11% ± 1,59 EHA (400) 11,68% ± 0,78 FD (200) 14,22% ± 2,66 FD (400) 20,24% ± 1,96 FA (200) 26,84% ± 3,73 FA (400) 70,06% ± 3,66 BHA (25) 23,26% ± 4,64 BHA (50) 73,55% ± 1,23

Pode-se verificar que entre as amostras testadas nesse estudo a fração acetato de etila (FA) das folhas de C. verticillata verticillata possui a maior concentração de compostos fenólicos e também foi a que apresentou maior atividade antioxidante pela metodologia do DPPH. Essa maior concentração de compostos fenólicos é resultado do processo de fracionamento que concentrou

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as substâncias fenólicas nessa fração devido a maior afinidade pelo solvente acetato de etila.

A utilização de compostos antioxidantes encontrados na dieta ou mesmo sintéticos é um dos mecanismos de defesa contra os radicais livres que podem ser empregados nas indústrias de alimentos, cosméticos, bebidas e também na medicina (BIANCHI & ANTUNES, 1999).

Os estudos sobre os antioxidantes têm ressaltado, principalmente, o uso de nutrientes isolados no tratamento e prevenção de doenças. Entretanto, nos alimentos e nas plantas medicinais são encontrados uma grande variedade de substâncias que podem atuar em sinergismo na proteção das células e tecidos (BIANCHI & ANTUNES, 1999).

A espécie Cissus quadrangularis, que possui compostos fenólicos, apresentou atividade antioxidante in vitro na metodologia do DPPH (OBEN et

al., 2007).

Na avaliação da atividade antioxidante, através da metodologia do DPPH, de tinturas vegetais vendidas em farmácias de manipulação a tintura de

Ginkgo biloba foi utilizada como referencia devido a sua alta atividade

antioxidante, sendo sua CE50 igual a 38,91 µg/mL. A tintura de própolis apresentou uma atividade antioxidante bem próxima da atividade do ginko biloba, sendo sua CE50 de 40,16 µg/mL. Isso se deve ao fato de que a própolis, material resinoso elaborado pelas abelhas a partir de brotos, cascas e outras partes do tecido vegetal de árvores e plantas, de um modo geral, é constituído principalmente por flavonóides, ácidos aromáticos e seus derivados (VICENTINO & MENEZES, 2007).

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Os chás são bebidas populares e fontes significativas de compostos fenólicos, são considerados importantes integrantes das dietas devido ao seu alto potencial antioxidante. Os extratos aquosos da macela, alecrim, erva-mate e malva apresentaram atividade antioxidante superior a 97% em teste in vitro (ASSOLINI et al., 2006).

Para que os compostos fenólicos sejam considerados antioxidantes e possam exercer seu papel biológico é necessário que, em baixa concentração, sejam capazes de impedir, retardar e prevenir a auto-oxidação ou oxidação mediada por radicais livres e que o produto formado após a reação seja estável. A avaliação da atividade antioxidante de alguns compostos fenólicos mostrou que a quercetina tem porcentagem de inibição, mesmo em menor concentração quando comparada à ácido gálico, ácido elágico, ácido clorogênico, catequina e rutina. Isso ocorre devido à quercetina ser um flavonol com cinco hidroxilas fenólicas reativas, sendo que duas destas estão ligadas ao anel B (anel que possui maior atividade redutora), apresentando estabilidade por ressonância. A rutina possui uma estrutura semelhante à da quercetina, mas com uma substituição glicosídica em uma das hidroxilas, por essa razão, apresenta uma menor atividade antioxidante (DUARTE-ALMEIDA

et al., 2006).

Na avaliação da atividade antioxidante pela metodologia do DPPH, o alcalóide montanina teve um percentual de atividade de 36% na concentração de 3,5 µg/mL. Já foi descrito a presença de alcalóides na espécie C. verticillata

62 5. CONCLUSÃO

Foi identificado através do perfil cromatográfico por CLAE o flavonóide rutina na fração acetato de etila das folhas de C. verticillata verticillata.

A fração acetato de etila teve a maior atividade antioxidante pela metodologia do DPPH e também a maior concentração de compostos fenólicos em equivalentes de ácido tânico.

Futuros estudos in vitro e in vivo para avaliar a atividade antioxidante da fração acetato de etila podem levar a identificação de novos compostos antioxidantes que poderão ser utilizados na terapêutica de doenças como a DM e hipertensão arterial.

63 CAPÍTULO 3

ATIVIDADE ANTIFÚNGICA DE Cissus verticillata (L.) Nicolson & C. E. Jarvis subsp. verticillata

1. INTRODUÇÃO