Determinação da atividade enzimática da NS-4

A determinação da atividade enzimática (hidrolítica) da formulação líquida da lipase NS-40116, utilizada como catalisador nas reações de produção dos ésteres metílicos a partir do óleo de polpa de macaúba bruto foi realizada em triplicata seguindo a metodologia descrita por Chiou e Wu (2004).

Utilizou-se 50 mL de p-nitrofenil palmitato (p-NPP) como substrato, dissolvidos em 100 mL de etanol. O aumento da absorbância,

a 410 nm, causado pela liberação do p-nitrofenol na hidrólise do p-NPP, foi determinado em espectrofotômetro. Um volume de 0,1 mL da lipase livre foi adicionado a uma mistura contendo 1 mL de solução de p-NPP 0,5% (m/v) e 0,5 mg/L de solução tampão fosfato (pH 7) incubados por 5 min a 30 ºC. A reação foi interrompida pela adição de 2 mL de solução de carbonato de sódio (Na2CO3) 0,5 mg/L, seguido de centrifugação por 10 min a 10.000 rpm. Retirou-se 0,5 mL do sobrenadante, o qual foi diluído 10 vezes em água destilada e então sua absorbância foi determinada em espectrofotômetro UV/VIS, a 410 nm. Utilizou-se um coeficiente de extinção molar (ε410) de 15.000 M-1cm-1 para o p-nitrofenol. Uma unidade (U) de atividade enzimática foi definida como sendo a quantidade de enzima que catalisa a produção de 1 µmol de p-nitrofenol por minuto, nas condições experimentais utilizadas. A atividade foi expressa em U/mL (CHIOU; WU, 2004). 3.2.4 Produção dos ésteres metílicos

A produção dos ésteres metílicos ocorreu em erlenmeyers aletados de 250 mL (Figura 12), os quais foram acondicionados em uma incubadora com agitação orbital (Shaker), marca Tecnal, modelo TE- 424 (Figura 13). Em todos os experimentos utilizou-se 100 g de óleo de polpa de macaúba bruto e uma velocidade constante de agitação orbital de 250 rpm.

As variáveis independentes avaliadas foram:

 Temperatura;

 Razão molar óleo:álcool*;

 Concentração do composto enzimático em relação à massa de óleo utilizada;

 Teor de água adicionada em relação à massa de óleo utilizada. * A quantidade de álcool (metanol) necessária em cada um dos experimentos foi dividida e adicionada em 6 partes iguais, nos tempos 0, 1, 2, 3, 4 e 5 h de reação, com a finalidade de não causar a inativação da enzima pelo excesso de álcool. Dessa forma, o mesmo já era consumido, em sua maior parte, na medida em que eram realizadas as adições ao meio reacional. Esse procedimento seguiu uma orientação do fabricante da enzima (NOVOZYMES, 2014).

Todos os experimentos realizados para produção dos ésteres metílicos, bem como a sequência dos mesmos, são apresentados a seguir.

3.2.4.1 Planejamento e ordem dos experimentos

A fim de determinar, entre as quatro variáveis analisadas, quais destas interferiam significativamente nos intervalos avaliados, inicialmente realizou-se um Delineamento Composto Central Rotacional (DCCR) onde todos os parâmetros foram analisados ao mesmo tempo. Este DCCR era composto por 16 pontos fatoriais (níveis -1 e +1), 8 pontos axiais (níveis –α e +α que nesse caso representam os níveis -2 e +2) e 6 pontos centrais (nível 0), representando um total de 30 experimentos. O esquema desse planejamento inicial está representado na Tabela 4, onde também estão os valores reais utilizados em cada um dos níveis, para os parâmetros avaliados. Os intervalos utilizados para cada uma das variáveis analisadas foram determinados a partir de dados encontrados na literatura, onde tentou-se englobar as condições de maior conversão encontradas por autores que trabalharam com sistemas reacionais similares, além da análise dos resultados de alguns testes já feitos anteriormente pelo grupo de pesquisa. O tempo de duração destes experimentos foi de 8 h, também definido após análise dos resultados de alguns trabalhos encontrados na literatura em que se utilizava catálise enzimática para produção de ésteres metílicos a partir de diferentes matérias-primas, percebeu-se que com esse tempo já era possível atingir um valor próximo à máxima conversão e, dessa forma, poder avaliar quais variáveis eram significativas e se essa interferência era positiva ou negativa. A variável dependente foi o teor de ésteres no produto final.

Tabela 4 - Valores das variáveis independentes utilizadas no 1º DCCR.

Variáveis Níveis

-2 -1 0 +1 +2

Temperatura (ºC) 35 40 45 50 55

Razão molar óleo:álcool 1:3 1:4,5 1:6 1:7,5 1:9 Conc. do comp. enzimático (% m/m) 0,05 0,25 0,45 0,65 0,85

Conc. de água (% m/m) 0 1 2 3 4

Como se trabalhou com um número alto de varáveis independentes, todas analisadas ao mesmo tempo em intervalos significativamente grandes e também devido ao fato de se utilizar um catalisador biológico, nesse primeiro planejamento se avaliou os resultados a um nível de significância de 90%, o qual já traz bastante relevância aos resultados, tendo-se em vista as condições empregadas.

Após a análise estatística dos resultados obtidos neste DCCR inicial, em relação ao teor de ésteres produzidos (variável dependente),

se determinou quais variáveis independentes interferiam significativamente nos resultados. Após isso, se padronizou aquelas variáveis que não causavam interferência no resultado, em um valor determinado após análise criteriosa dos resultados e das condições de processo utilizadas, e se realizou um novo DCCR, agora apenas com as variáreis que interferiram significativamente na variável dependente no 1º DCCR, nos intervalos avaliados. As variáveis independentes e as condições deste 2º DCCR estão expostas na seção Resultados e Discussão, pois as mesmas são parte da avaliação dos resultados obtidos no planejamento experimental realizado inicialmente.

No segundo Delineamento Composto Central Rotacional, agora com apenas as variáveis mais relevantes e interferentes no resultado final, e trabalhando mais próximo da condição de maior conversão, a avaliação dos resultados experimentais foi realizada com um nível de significância de 95%.

Em seguida, com o intuito de avaliar a reação no decorrer do tempo, realizaram-se cinéticas destrutivas de produção dos ésteres metílicos, com coleta e análise dos resultados em 0, 2, 4, 6, 8, 18, 24, 32, 40 e 48 h. Para a realização destas cinéticas, foram utilizadas as condições de maior produção de ésteres, a partir do segundo planejamento experimental realizado.

3.2.4.2 Purificação dos ésteres produzidos

Após o término das reações no Shaker, era realizada uma centrifugação do meio reacional, a qual tem a finalidade de separar os ésteres produzidos (biodiesel) do glicerol e do composto enzimático, além de outras substâncias que poderiam estar em solução, como resíduos de água e álcool, por exemplo. Esta separação era realizada em uma centrífuga de tubos marca Quimis, modelo Q222T, onde o meio reacional resultante dos experimentos era centrifugado a 10.000 rpm durante 15 min.

Após a centrifugação, o sobrenadante (fase rica em ésteres) era colocado em frascos âmbar específicos para essa finalidade e se realizou uma evaporação a fim de eliminar o álcool não reagido e a água residual que poderia ainda estar presente.

Utilizou-se uma estufa a vácuo marca Quimis, modelo Q819V2, a qual era acoplada à uma bomba a vácuo de mesma marca e modelo, na temperatura de 80 ºC e pressão de 0,1 bar, até que as amostras atingissem massa constante.

3.2.5 Análise dos produtos gerados