Determinação da atividade lipolítica e produtividade

A determinação da atividade lipolítica foi determinada segundo método descrito por Burkert et al. (2004). O método é baseado na titulação com NaOH 0,05N dos ácidos graxos liberados pela ação da enzima lipase, presente no extrato enzimático da fermentação, sobre os triacilglicerídeos do óleo de oliva emulsionados em goma arábica. A atividade lipolítica foi determinada a cada 24 h, juntamente com um ensaio

branco. Os valores de atividade e produtividade enzimático foram definidas pelas Equações 1 e 2:

(1)

(2)

Onde:

= Atividade lipolítica (U.mL^-1)

= diferença entre o volume gasto de NaOH para titular amostra e o volume gasto para titular o branco (mL)

= Normalidade da solução de NaOH = Volume de caldo utilizado (mL)

= tempo de reação(h)

= Produtividade enzimática (U.mL^-1.h^-1)

= Tempo de fermentação (h)

3-Resultados e Discussão

A Tabela 2 apresenta a composição proximal do resíduo de corvina utilizado para produção de lipase. Analisando a Tabela 2 pode-se observar que o resíduo possui valor de umidade, aproximadamente de 74%. Porém, se encontra abaixo do encontrado por Badolato et al (1994) que foi de 77,2-83,8%. Avaliando os teores obtidos de proteínas e gordura da corvina, foi possível classificar a espécie estudada como concentração intermediaria em proteína (15-20%), e baixo conteúdo em gordura (<5%), conforme classificação de Stansby, reportado por Contreras (1994). A composição proximal da corvina, apresentada na Tabela 6, revelou que os valores para a matéria-prima são ligeiramente diferentes dos reportados por Badolato et al (1994), que obteve 0,8-1% gordura, 1-1,2% de cinzas e 14,5-20,7% de proteínas. A

corvina de acordo com Yeannes e Almandos (2003) pode sofre variação na sua composição conforme os tecidos, sexo, idade do pescado e estação do ano.

Tabela 2 - Composição proximal dos resíduos de corvina (Micropogonias furnieri)

Composição (%)

Umidade 73,92+0,47

Cinzas 2,38+0,48

Proteínas 18,97+3,25

Lipídeos 4,49+0,47

Carboidratos 0,24+0,00

Importante conhecer a composição da matéria prima utilizada como substrato, a fim de verificar a quantidade de carbono e nitrogênio, pois a composição do substrato é importante para produção de biossurfactante e lipase devido que o micro-organismo utilizará carbono e nitrogênio disponível para produzir o bioproduto desejado.

3.1-Produção de lipase em biorreatores sem chicanas

A Tabela 3 apresenta os resultados obtidos no planejamento utilizado para avaliar a produção de lipase em erlenmeyers sem chicanas. As análises de atividade lipolítica e produtividade foram realizadas no tempo de 72 h.

Tabela 3- Resultados do planejamento para a atividade enzimática e produtividade U.mL^-1 para o ensaio onde foi utilizado a menor concentração de pescado. Utilizando a Corynebacterium aquaticum o maior valor de atividade foi de 15,91 U.mL^-1, sendo este valor obtido também na menor concentração de pescado (0,83%). Nos experimentos onde foi utilizado o misto de micro-organismo o melhor resultado foi de 7,00 U.mL^-1. A produtividade enzimática máxima obtida ocorreu no experimento 7 onde se utilizou 0,83% e micro-organismo Corynebacterium aquaticum. A menor produtividade foi obtida no ensaio 5 onde utilizou-se 1,66% de pescado e misto dos micro-organismos.

O resultado de atividade lipolítica máxima obtida no trabalho foi de 15,91 U.mL

-1, sendo este maior que o valor obtido por Pinheiro et al. (2008), que avaliou a produção de lipase em fermentação submersa por Penicillium verrucosum, obtendo uma atividade lipolítica máxima de 3,15 U.mL^-1 em 96 h de fermentação, utilizando com fonte de carbono óleo de oliva. Tavares et al. (2012), utilizando Bacillus licheniformis e óleo de soja com fonte de carbono, constatou que a maior atividade lipolítica obtida foi de 126 U.mL^-1, em 80 h.

Vários autores, como Mahadik et al. (2002) e Baron et al. (2005), utilizaram o azeite de oliva como substrato na produção de lipases. Entretanto, o custo da adição

de azeite de oliva com fonte de carbono é elevado se for considerada a produção de enzimas em larga escala. Desta forma, pode-se estudar a utilização de outras fontes, como os resíduos agroindústrias, o qual é facilmente obtido, visto que é gerado em grande quantidade na indústria.

A Figura 1 apresenta a atividade lipolítica e a Figura 2 apresenta a produtividade enzimática durante o processo fermentativo.

Figura 1 – atividade enzimática do planejamento com erlenmeyers sem chicanas Observa-se nas Figuras 1 e 2 que em praticamente todos os experimentos há queda na atividade lipolítica e consequentemente da produtividade ao final da fermentação. Segundo pesquisadores, isto ocorre devido às proteases que também são liberadas no meio durante o processo fermentativo e que acabam por hidrolisar as lipases produzidas (Burkert et al., 2004; Ohnishi et al., 1994). Rivera-Munõz et al.

(1991) observaram que os melhores micro-organismos produtores de lipases foram produtores intermediários de proteases.

Padilha et al. (2011) realizaram a produção de lipase por fermentação submersa utilizando Pseudomonas cepacia, 3% de óleo de soja como substrato e as condições de 30 °C, pH 7,0, aeração de 1,5 vvm e agitação de 150 rpm durante 96h, obtendo como máxima atividade lipolítica 1,85 U.mL^-1.

Segundo Padilha et al.,(2011) o fator que pode ter afetado os resultados da produção de lipase é o coeficiente de condutividade térmica do meio em que a enzima está exposta, sendo que este fator influência na inativação enzimática e com isso pode-se obter baixa atividade enzimática, devido ao fato de que algumas enzimas podem perder sua atividade com pequenas variações na temperatura, pois a mudança em sua conformação faz com que seu sítio ativo perca a especificidade de reagir com o substrato. Isso ocorre geralmente devido ao fato de a fermentação submersa possibilitar maior transferência de calor do que a fermentação em estado sólido (Singhania et al., 2009).

Figura 2 – Produtividade enzimática do planejamento com erlenmeyers sem chicanas Na Figura 2 demostra que maiores valores de produtividade se encontram no tempo de 24h e reduzindo ao longo do tempo de fermentação. Deste modo após 24h de fermentação tem alta produtividade que durante o processo diminui devido que diminui a atividade lipolítica e consequentemente reduz a produtividade.

Na Tabela 4 demostra os efeitos principais para todas as variáveis estudadas e as respectivas interações dos cultivos em erlernmeyers sem chicanas.

Tabela 4 – Efeitos das variáveis do planejamento experimental na atividade lipolítica e

L= Efeito linear; Q= Efeito quadrático; p= nível de significância.

Observa-se que nenhum fator influenciou significativamente (p<0,05) a atividade lipolítica e a produtividade enzimática. Ao estreitar o intervalo de confiança para 80% para a resposta de atividade lipolítica, observou-se que a variável pescado (L) foi à única que passou a ser significativa. Em relação à produtividade, nenhuma variável foi a única significativa (p<0,20) .

3.2-Produção de lipase em biorreator com chicanas

A Tabela 5 apresenta os resultados obtidos no planejamento utilizado para avaliar a produção de lipase em erlenmeyers com chicanas. Foram utilizados os resultados de atividade lipolítica e produtividade no tempo máximo de fermentação (72h).

Tabela 5 – Resultados do planejamento para a atividade enzimática e produtividade

A atividade lipolítica máxima encontrada para Bacillus subtilis foi de 5,79 U.mL^-1 para o ensaio onde se utilizou a menor concentração de pescado (0,83%). Utilizando a Corynebacterium aquaticum, o maior valor de atividade foi de 11,45 U.mL^-1, sendo utilizado também a menor concentração de pescado (0,83%). Nos experimentos onde se utilizou o misto de micro-organismos o melhor resultado foi de 1,88 U.mL^-1.

A produtividade enzimática máxima foi obtida no experimento 7, onde se utilizou 0,83% de pescado e micro-organismo Corynebacterium aquaticum.

Carvalho (2012) avaliou a co-produção de lipase durante a produção de biossurfactante por bactérias isoladas de um solo contaminado com óleo vegetal residual, sendo utilizado o azeite de oliva como fonte de carbono, os maiores valores de atividade lipolítica obtidos pelo autor foram para linhagens O19, O17 e O45, com 12,4 U.mL^-1, 10,00 U.mL^-1 e 10,5 U.mL^-1, respectivamente. Em algumas linhagens obteve valores bem baixos, entre estes destacam-se as linhagens O30 com atividade lipolítica de 0,68 U.mL^-1, O57 com atividade de 0,81 U.mL^-1 e O7 e O8 com atividade de 0,62 U.mL^-1.

As Figuras 3 e 4 mostram a atividade lipolítica e a produtividade enzimática durante o processo fermentativo.

Figura 3 -atividade enzimática do planejamento com erlenmeyers com chicanas

Figura 4 - Produtividade enzimática do planejamento com erlenmeyers com chicanas

O gráfico da Figura 4, mostra que para maioria dos ensaios, os maiores valores de produtividade foram obtidos no tempo de 24 h tendo logo após decaído. Isso provavelmente ocorre devido que durante o processo são liberados proteases, as quais hidrolisam as lipases produzidas e com isso diminui a atividade lipolítica (Burkert et al., 2004; Ohnishi et al., 1994), com a redução da atividade ocorre também redução da produtividade. Fato que pode ser observando a Figura 3 em que durante o processo houve redução da atividade na maioria dos ensaios.

Na Tabela 6, estão expostos os efeitos principais para as variáveis estudadas e as respectivas interações.

Tabela 6 – Efeitos das variáveis do planejamento experimental na atividade lipolítica e na produtividade elernmeyers com chicanas.

L= Efeito linear; Q= Efeito quadrático; p= nível de significância.

Observa-se na Tabela 6 que nenhum fator influenciou a atividade lipolítica e a produtividade enzimática significativamente (p<0,05). Ao estreitar o intervalo de confiança para 80% em relação à produtividade, a interação entre micro-organismo (L) e Pescado (L) e micro-organismo (Q), pescado (L) são as variáveis significativa (p<0,20) .

A produção de lipase é amplamente reportada a partir de substratos complexos ou constituído por muitos açúcares (Del Rio et al., 1990). De qualquer maneira, a alternativa de uso de substratos alternativos para a produção de lipase microbiana deve ser estudada, pois há possibilidade de redução do custo do processo, além de possuir um grande apelo ambiental.

Uma observação interessante de ressaltar é que os valores obtidos para atividade lipolítica e produtividade enzimática nos erlenmeyers sem chicanas foram maiores do que os obtidos na fermentação em biorreatores com chicanas. O fator que provavelmente afetou negativamente a produção de lipase foi aeração, pois nos erlenmeyers com chicanas se tem uma aeração maior do que nos sem chicanas.

Porém, vários autores relataram que a aeração, em alguns casos, é essencial para que os micro-organismos produzam lipase (Vadehra; Harmon, 1969). Lee e Rhee (1993), conseguiram aumentar a produção de lipase a partir da bactéria Pseudomonas putida sob condições distintas de aeração e agitação. Elibol e Ozer(2000) obtiveram aumento da produtividade da lipase produzida pelo fungo Rhizopus arrhizus aumentando a taxa de aeração.

4-Conclusão

A produção de lipase por fermentação submersa foi possível em ambos biorreatores. Porém, o cultivo utilizando erlenmeyers com chicanas obteve menor atividade lipolítica do que sem chicanas, sendo obtido para biorreator com chicanas 11,45 U.mL^-1 de atividade lipolítica máxima, e para erlenmeyers sem chicanas 15,91 U.mL^-1. Sendo que em ambos o melhor ensaio foi o que utilizou 0,83% de pescado e o micro-organismo Corynebacterium aquaticum.

As lipases produzidas podem ser utilizadas posteriormente no tratamento de efluentes oleosos entre outras aplicações.

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