Determinação da atividade sequestradora do radical DPPH

No teste do DPPH o 6CN mostrou atividade sequestradora (Tabela 3), obtendo um valor de CE50 = 4,7± 0,06 μg/ml, comparado ao ácido ascórbico (3,1 ± 0,02 μg/ml), um antioxidante padrão.

Tabela 3: Atividade sequestradora do radical DPPH

DPPH CE50 (μg/mL)

6CN 4,7 ± 0,06

Ac. Ascórbico 3,1 ± 0,02

5.6.2. Determinação da capacidade antioxidante equivalente ao trolox (CAET).

Ao determinar a capacidade antioxidante se assemelhando ao trolox (CAET) do 6CN, obteve-se uma CE50 de 1,1 ± 0,01 μg/mL (Tabela 3), enquanto que o Trolox, utilizado como padrão a CE50 foi 3,0 ± 0,01 μg/mL, mostrando assim, uma atividade sequestradora significativa do 6CN.

Tabela 3: Determinação da capacidade antioxidante equivalente ao trolox (CAET).

ABTS CE50 (μg/ml)

6CN 1,1 ± 0,01

Este estudo traçou um perfil da toxicidade aguda e da atividade do 6CN sobre o SNC, investigando as atividades antinociceptiva e antioxidante e por qual(is) mecanismo(s) de ação o 6CN estaria exercendo essas referidas atividades. A via de administração utilizada neste estudo foi a intraperitoneal (i.p.), por ser a mais utilizada em pesquisas com animais, de fácil procedimento e rápida absorção, chegando a atingir o efeito esperado em tempo bem próximo ao alcançado pela via endovenosa (LUKAS; BRINDLE, 1971).

Os estudos com o 6CN iniciaram com a avaliação da toxicidade aguda, e, para tal, o derivado tiofênico foi administrado nas doses de 50, 100, 250, 500, 750 e 1000 mg/kg por via i.p., sendo observado o número de mortes por um período de 14 dias. Essa etapa é fundamental para o uso seguro de uma substância, visto que fornece informações das doses capazes de provocar efeitos tóxicos para estudos pré-clínicos (EATON; KLAASSEN, 1996; SÁ; ALMEIDA, 2006). Além disto, foi realizado o cálculo da DL50, que teve por objetivo caracterizar a relação dose/resposta, ou seja, a dose que apresenta um efeito letal em 50% dos animais de uma determinada população (LITCHFIELD; WILCOXON, 1949). No presente estudo determinou-se uma DL50 do 6CN com baixa toxicidade, permitindo que as doses terapêuticas estudadas fossem seguras.

Com a finalidade de traçar um perfil de ação do 6CN no Sistema Nervoso, foi utilizada a triagem farmacológica comportamental que é um teste preliminar de fácil execução que possibilita investigar o perfil farmacológico de uma substância, de forma qualitativa e algumas de suas ações sobre o Sistema Nervoso Central e Sistema Nervoso Autônomo (ALMEIDA et al., 1999; ALMEIDA; OLIVEIRA, 2006).

Nesse experimento, os grupos de camundongos tratados com 6CN nas doses de 100, 250, 500, 750 e 1000 mg/kg apresentaram alterações comportamentais sugestivas de drogas depressoras do SNC, tais como diminuição da ambulação, resposta ao toque diminuída e perda do reflexo corneal e auricular. A diminuição da ambulação é um dos parâmetros mais comuns para analisar o efeito depressor de uma substância sobre o SNC. Outro efeito que confirma esse parâmetro é o aumento da latência de reação

ambos os parâmetros foram observados com a administração do 6CN, sugerindo de maneira preliminar, um efeito depressor sobre o SNC.

Outro parâmetro observado foi a analgesia, avaliado por meio do aumento da latência na resposta do animal ao sofrer uma pressão no terço inferior da cauda (ALMEIDA; OLIVEIRA, 2006). Esse efeito foi observado de maneira intensa em todas as doses analisadas, indicando que testes para avaliar a atividade antinociceptiva do 6CN poderiam fornecer resultados promissores.

Com base nos resultados da DL50 e da triagem farmacológica comportamental, foram definidas as doses do 6CN, em 25, 50 e 100 mg/kg de peso corporal, que foram utilizadas nos testes farmacológicos específicos de avaliação da atividade sobre o SNC.

Para confirmar e melhor caracterizar a atividade psicodepressora do 6CN observada na triagem farmacológica comportamental, foram escolhidos dois testes gerais que são utilizados para avaliação de drogas com atividade sobre o SNC, o teste do campo aberto e o teste do rota-rod.

O teste do campo aberto é utilizado como medida de emocionalidade em roedores (BROADHURST, 1978; ALBONETTI; FARABOLLINI, 1992), além de ser utilizado para estudar os efeitos de ansiolíticos e outras classes de drogas sobre o comportamento em um novo ambiente. Dessa forma, a locomoção, rearing e grooming em roedores observados no campo aberto são os parâmetros comportamentais mais usados para descrever influências dos eventos ambientais ou da administração de drogas (MONTGOMERY, 1995; REX et al., 1996).

A remoção do animal de seu ambiente familiar, sua transferência para o campo aberto, bem como a exposição ao ambiente do teste (composto pelo próprio campo aberto e por suas paredes) são os principais fatores ansiogênicos desse modelo (WALSH; CUMMINS, 1976; ENNACEUR; MICHALIKOVA; CHAZOT, 2006).

Os resultados obtidos para a locomoção, rearing e grooming, mostraram uma diminuição nesses três parâmetros quando comparados aos resultados apresentados pelo grupo controle. Esses resultados complementaram as evidências de que 6CN possuía um perfil depressor sobre

referência utilizada no protocolo experimental, também apresenta uma redução nesses três parâmetros.

O parâmetro auto-limpeza ou grooming é um comportamento inato do animal, que geralmente se encontra exacerbado em situações de estresse. Drogas ansiolíticas diminuem o tempo de grooming no teste do campo aberto (KALUEFF; TUOHIMAA, 2005). O 6CN foi capaz de diminuir esse parâmetro em todas as doses testadas, indicando uma possível atividade ansiolítica.

No teste do rota-rod os resultados obtidos indicaram que o 6CN nos primeiros 30 min, possuía um efeito miorrelaxante, sem, contudo, exibir esse comportamento nos tempos de 60 e 120 minutos posteriores.

Depressores do SNC (neurolépticos, benzodiazepínicos, barbitúricos e etanol), bem como relaxantes musculares, reduzem o tempo de permanência dos animais na barra giratória (KURIBARA; HIGUCHI; TADOKORO, 1977; CARLINI; BURGOS, 1979; MATTEI; FRANÇA, 2006; PULTRINI; GALINDO; COSTA, 2006). O 6CN pode ser uma droga com características sedativas ou hipnóticas (ou mesmo neurotóxica) devido ao efeito de aumentar o tempo de sono induzido pelo tiopental, sugerindo um possível efeito central (DE SOUSA et al., 2007; MATTEI, FRANÇA, 2006; PULTRINI, GALINDO e COSTA, 2006)

Para verificar o efeito ansiolítico do 6CN foi realizado o teste do labirinto em cruz elevado (LCE). Esse teste tem sido amplamente utilizado para o estudo de novas drogas com potencial ansiolítico, sendo igualmente sensível àquelas com perfil ansiogênico. Esse modelo baseia-se no conhecimento de que roedores evitam lugares abertos e elevados. O animal, tipicamente, entrará com maior frequência e permanecerá mais tempo nos braços fechados. Uma maior intensidade de ansiedade equivale à menor preferência pelos braços abertos (MORATO; BRANDÃO, 1997).

Os animais tratados com as doses de 25 e 50 mg/kg do 6CN apresentaram um aumento no número de entradas e no tempo de permanência nos braços abertos, além de uma redução no tempo de permanência nos braços fechados. Esses resultados são sugestivos de atividade ansiolítica. Entretanto a dose de 100 mg/kg do 6CN não apresentou um efeito ansiolítico, tendo sido apenas verificado uma diminuição no número de entrada nos braços

Tiofênicos 2-amino substituídos com perfil ansiolítico já foram encontrados. O tiofênico 2-[(2,6-diclorobenzilene) amino]-5,6-diidro-4H- ciclopenta[b]tiofene-3-carbonitrile), 5TIO1, demonstrou atividade ansiolítica quando foi realizado o teste do LCE (FORTES et al., 2013).

Esses resultados, aliados ao comportamento depressor observado na triagem farmacológica comportamental e nas doses avaliadas no teste do campo aberto corroboram o perfil sedativo deste composto.

De acordo com a literatura, os benzodiazepínicos, tais como o diazepam, e anticonvulsivantes agem como os ansiolíticos (em doses baixas), produzindo também sedação e efeito relaxante muscular em doses altas (ONAIVI et al., 1992; WOLFFGRAMM et al., 1994). Com base nas características farmacológicas destas classes de fármacos, foi avaliado o efeito do 6CN no tempo de sono induzido pelo tiopental.

Este teste se baseia no fato de que, em geral, as drogas depressoras do sistema nervoso central atuam sinergicamente aumentando o tempo de sono induzido por barbitúricos (RILEY; SPINKS, 1958).

É conhecido que a diminuição na latência de sono e o aumento no tempo de sono são classicamente relatados por drogas depressoras do SNC (WILLIANSON et al., 1996). Os resultados mostraram que o 6CN, nas doses de 50 e 100 mg/kg, aumentou a duração do sono, de maneira semelhante ao diazepam, achados esses que são indicativos de um efeito sedativo por potencialização do tiopental no teste do tempo do sono.

Dados na literatura mostram que o tiopental interage com outras drogas depressoras centrais, levando a um efeito sinérgico expresso pelo aumento do tempo de sono. De modo semelhante, sabe-se que diminuições nos parâmetros observados no campo aberto refletem um efeito sedativo (OZTURK et al., 1996) obtido por drogas que atuam deprimindo o SNC, como os benzodiazepínicos. O fato dos animais testados no LCE, na dose de 100 mg/kg, diminuírem o número de entradas e o tempo de permanência nos braços abertos, não indica uma possível atividade ansiogênica de 6CN e sim, uma atividade sedativa que inibi a ambulação e o comportamento exploratório

6CN tem uma ação depressora no Sistema Nervoso Central.

O 6CN, durante a triagem farmacológica comportamental, apresentou perfil de droga antinociceptiva. Para confirmar esse efeito foram utilizados modelos de nocicepção química (teste das contorções abdominais induzidas por ácido acético e teste da formalina) e térmica (teste da placa quente). O uso de vários modelos é imprescindível para a detecção das propriedades antinociceptivas de uma substância, uma vez que diferentes estímulos mimetizam diferentes tipos de dor e revelam a natureza antinociceptiva de uma droga teste (BERGEROT et al., 2006).

No teste do ácido acético, a atividade antinociceptiva do 6CN, foi observada em todas as doses testadas. Tanto em relação à latência para a primeira contorção abdominal, como também em relação ao número de contorções abdominais, onde foi visto uma diminuição significativa em relação ao controle e de forma equivalente à morfina.

No entanto, o teste do ácido acético trata-se de um método não específico, uma vez que as drogas analgésicas centrais reduzem ou mesmo inibem as contorções abdominais, mas também, outras drogas, tais como os anti-inflamatórios não-esteroidais, anticolinérgicos e anti-histamínicos se mostram eficazes em inibir estas contorções, comprovando, assim, a baixa especificidade deste teste (COLLIER et al., 1968; ALMEIDA; OLIVEIRA, 2006).

Para confirmar um efeito antinociceptivo de 6CN, foi realizado o teste da formalina, que caracteriza o tipo de analgésico, dependendo da sua ação. Na 1ª fase do teste (neurogênica), apenas a dose de 100 mg/kg de 6CN apresentou efeito antinociceptivo. Na segunda fase (inflamatória), todas as doses foram capazes de inibir o tempo de lambida da pata direita quando comparado com o grupo controle. Esses resultados sugerem que o 6CN pode atuar tanto no sistema nervoso central, como também por via periférica.

Para verificar se, realmente, o 6CN apresenta efeito central, foi feito o teste da placa quente, pois esse teste é sensível e específico para drogas que atuam por um mecanismo central, como os analgésicos opioides (NEMIROVSKY et al., 2001). O experimento mostrou que 6CN na dose de 50 mg/kg apresentou efeito nos primeiros 30 minutos, e a dose de 100mg/kg,

morfina, confirmando o efeito central do derivado.

Estudos realizados pelo nosso grupo de pesquisa verificaram que o tiofeno 2-[(4-nitro-benzilideno)-amino]-4,5,6,7-tetraidro-benzo[b]tiofeno-3- carbonitrila (6CN10), apresenta atividade antinociceptiva e anti-inflamatória (MOTA, 2012). Esse estudo foi realizado nas mesmas condições experimentais do 6CN, utilizando os mesmos testes de antinocicepção e doses equivalentes. A reação de síntese do 6CN10 é realizada a partir do 6CN, assim, essas moléculas possuem estruturas químicas semelhantes. No entanto, o 6CN apresenta vantagem em relação ao 6CN10 devido ao custo da reação, já que o 6CN é o precursor, além disso possui uma estrutura química mais simples.

Depois de caracterizado o efeito antinociceptivo do 6CN, tanto em nível central como periférico nas doses analisadas, o próximo passo foi elucidar os mecanismos pelos quais o 6CN exerce a ação antinociceptiva.

A investigação dos mecanismos de ação de psicofármacos, geralmente, é baseada na interação farmacológica que ocorre entre receptores e ligantes durante a transmissão neuronal (SCHEFFER, 2006). Utilizam-se antagonistas farmacológicos, os quais, uma vez administrados, bloqueiam os efeitos decorrentes da ativação do receptor específico, impedindo que a substância em estudo possa se ligar a esse receptor e promover sua ação. Caso a via de sinalização bloqueada não seja o mecanismo usado pela substância-teste, o efeito não será alterado.

Desta forma, na tentativa de elucidar os mecanismos antinociceptivo pelo qual o 6CN exerceu seu efeito, foram utilizados diferentes antagonistas farmacológicos que atuam em diferentes vias de sinalização. A dose de 100 mg/kg do 6CN foi escolhida, por ser a dose que apresentou os melhores resultados durante os testes nociceptivos. Durante essa etapa, foi utilizado o teste da formalina, por ser o modelo ideal para identificar se o efeito antinociceptivo da substância é por via de sinalização central e/ou periférica e possíveis mecanismos do efeito (HUANG et al., 2010).

Inicialmente, investigamos o possível mecanismo de ação, do 6CN na via dos receptores opioides. Está bem estabelecido que a ativação desses receptores parece mediar uma variedade de efeitos farmacológicos, alguns deles relacionados com as suas ações terapêuticas, como analgesia, além de

2008). Utilizou-se como antagonista opiaceo a naloxona, amplamente utilizada como ferramenta farmacológica, em estudos para a elucidação de mecanismos de ação de novas substâncias e como agonista, a morfina, que é o principal fármaco dos opiaceos, o que faz com que ela seja a droga mais utilizada para comparar a potência antinociceptiva de novas substâncias (JIN et al., 2010).

Os receptores opioides (mu, kappa e delta) estão localizados tanto em nível central como periférico, nas terminações de neurônios aferentes primários (WARD; TAKEMORI, 1983; BRUEHL et al., 2009). Todos os receptores opioides são classificados como receptores acoplados à proteína Gi/o. Quando estes receptores são ativados ocorre inibição da atividade da enzima adenilil ciclase, responsável pelo aumento dos níveis intracelulares de AMPc e a entrada de cálcio na célula é impedida. Além disso, os canais de K+ATP são abertos, ocorrendo um efluxo de K+ hiperpolarizando a célula, o que resulta no bloqueio da liberação dos neurotransmissores e da transmissão da dor em diversas vias neuronais levando à redução na excitabilidade neuronal (MCDONALD; LAMBERT, 2008).

Os resultados evidenciaram que o pré-tratamento dos animais com naloxona, um antagonista não seletivo dos receptores opioides, é capaz de inibir completamente o efeito antinociceptivo da morfina nas duas fases do teste. Ao testar os efeitos da interação da naloxona com o 6CN, foi observado que a naloxona não foi capaz de reverter o efeito antinociceptivo do 6CN, nas duas fases do teste da formalina.

Estudos realizados por Gonçales e colaboradores (2005), demonstraram que derivados tiofênicos acetilados induziram antinocicepção no teste da contorção abdominal e que esse efeito foi mediado por receptores opioides. Outro estudo realizado por Mota (2012), no entanto, mostrou a não participação dessa via, utilizando o 6CN10. O fato do efeito antinociceptivo 6CN não estar relacionado com a via opioide era esperado, por apresentar semelhanças estruturais ao 6CN10.

A participação da via dopaminérgica foi avaliada na atividade antinociceptiva do 6CN. A dopamina é um neurotransmissor cujo papel está bem evidenciado em neuropatologias como Parkinson, a depressão e a esquizofrenia (TARAZI, 2001). Suas ações neuroquímicas e fisiológicas são

subtipos que se estendem desde o D1 até o receptor D5. Os subtipos subdividem-se devido as suas habilidades de estimular (D1 e D5) ou inibir (D2, D3 e D4) a adenililciclase aumentando e diminuindo a produção de AMPc, respectivamente (TARAZI, 2001).

Estudos sugerem que a ativação de neurônios dopaminérgicos mesolímbicos, que partem da área tegumentar ventral (VTA) e projetam-se para o núcleo acumbens (NA) parece ter um importante papel mediando a supressão da dor tônica (ALTIER e STEWART, 1999). Outros estudos sugerem que esse sistema de supressão da dor envolvendo neurônios dopaminérgicos mesolímbicos é naturalmente ativado pela exposição ao estresse, via liberação de opioides endógenos (TAYLOR, JOSHI e UPPAL, 2003; WOOD, 2004). A participação da via dopaminérgica no efeito antinociceptivo do 6CN foi observada na fase inflamatória. O antagonista haloperidol foi capaz de inibir o efeito antinociceptivo do 6CN.

Outra via estudada para desvendar o mecanismo de ação do 6CN foi a dos receptores da adenosina, utilizando a cafeína, um antagonista envolvido no processo da nocicepção.

A adenosina é um neurotransmissor/modulador endógeno que atua sobre receptores de membrana específicos acoplados a proteína G. Quatro subtipos de receptores de adenosina já foram caracterizados farmacologicamente: A1, A2A, A2B e A3 (WU et al., 2005). Os receptores de adenosina do tipo A1 estão associados à antinocicepção, por inibição da atividade neuronal na medula espinhal e do gânglio da raiz dorsal, enquanto os receptores A2A, A2B e A3, estão envolvidos com atividades pró – nociceptivas (WU et al., 2005). A cafeína é um antagonista não seletivo de receptores de adenosina, apresentando afinidade aos receptores do tipo A1 e A2 (SAWYNOK; REID; DOAK, 1995; SAWYNOK; REID; FREDHOLM, 2010). Os resultados encontrados mostram que a cafeína inibiu o efeito do 6CN nas duas fases do teste da formalina, neurogênica e inflamatória, demonstrando a participação dessa via no efeito antinociceptivo do derivado tiofênico.

Muitos estudos mostram o envolvimento dos receptores GABA na modulação da dor, essencialmente através do sistema inibitório descendente (MATSUMOTO, 1989; MACDONALD; OLSEN, 1994; TATSUO et al., 1997).

como “portas”, controlando a transmissão do sinal nociceptivo da periferia até o sistema nervoso central (ZEILHOFER; MOHLER; DI LIO, 2009). Estudos recentes sugerem que um déficit na inibição mediada pelo neurotransmissor GABA na medula espinhal está relacionado com o surgimento da dor de diversas origens (ZEILHOFER, 2008; ZEILHOFER; MOHLER; DI LIO, 2009).

Embora haja progresso no desenvolvimento de novos fármacos, a utilização sistêmica de agonistas GABAérgicos é limitada por efeitos colaterais em outros sistemas que não estão envolvidos na dor (JASMIN; WU;OHARA, 2004; ENNA; MCCARSON, 2006).

Testes foram realizados para verificar a participação do sistema gabaérgico no efeito antinociceptivo do 6CN, no entanto, os resultados obtidos utilizando a bicuculina, antagonista do receptor GABAA, não mostraram reversão do efeito do 6CN nas duas fases do teste da formalina.

O sistema L-arginina óxido nítrico tem sido relacionado com modelos de nocicepção. L-NAME, um inibidor da biossíntese do óxido nítrico, administrado tanto por via sistêmica como por via intracerebroventricular, causa pronunciado efeito analgésico na segunda fase do teste da formalina, bem como da placa quente e do tail-flick (FÜRST, 1999; MILLAN, 1999). No entanto, não foi encontrada evidência da participação da via L-arginina - óxido nítrico nas duas fases do teste da formalina, uma vez que não houve reversão do efeito promovido pelo 6CN ao adicionarmos a L-arginina.

Com o objetivo de investigar a participação dos canais de K+

ATP na antinocicepção causada pelo 6CN, utilizou-se uma sulfonilureia, a glibenclamida, bastante usada na prática clínica em pacientes diabéticos tipo 2 (OCAÑA et al., 2004).

Os canais de K+ _{neurais estão divididos em quatro classes, de} acordo com as suas estruturas e agonistas específicos, sendo conhecidos como canais de K+ dependente de voltagem (Kv), ativados por cálcio (KCa), retificador de entrada (Kir) e de dois poros (K2P) (GUTMAN et al, 2003). É sabido que os canais de K+ centrais, especialmente os canais de K+ dependente de voltagem, pertencem à família Kir e estão envolvidos na percepção da dor (OCAÑA et al., 2004; HAJHASHEMI; AMIN, 2011).

como diazoxida, minoxidil e cromacalina, produz antinocicepção além de serem capazes de potencializar o efeito analgésico de agonistas opioides e α2- adrenérgicos (GALEOTTI et al., 1999, WELCH; DUNLOW, 1993).

Os resultados mostraram que a glibenclamida não atenua a dor na primeira e na segunda fase do teste da formalina, como mostrado em estudos anteriores (WELCH; DUNLOW, 1993; HAJHASHEMI; AMIN, 2011). O pré- tratamento com a sulfonilureia também não foi capaz de inibir o efeito antinociceptivo do 6CN nas fases do teste da formalina, indicando a não- participação dessa via.

Dando continuidade aos estudos, na tentativa de saber se o efeito antinociceptivo do 6CN poderia estar envolvido com receptores muscarínicos, foi testada a ação da atropina sobre o efeito antinociceptivo do 6CN. A atropina é uma droga parassimpaticolítica e antagonista não seletiva de receptores muscarínicos e tem sido muito utilizada para ajudar na elucidação de mecanismos farmacológicos de drogas diversas (PEANA et al., 2003; AYOKA et al., 2006).

Com base nos resultados obtidos, a atropina não foi capaz de reverter o efeito do 6CN em nenhuma das fases do teste da formalina, o que sugere dessa forma, que o mecanismo do efeito antinociceptivo do 6CN não está envolvido com receptores muscarínicos.

Os radicais livres e espécies reativas relacionadas estão envolvidos em diversos processos patológicos e fisiológicos, incluindo inflamação e dor (SALVEMINI et al., 2006). Há muitos métodos diferentes para determinar a capacidade antioxidante de uma amostra. Estes métodos diferem quanto ao princípio do teste e condições experimentais. A maioria deles é baseada na reação em que o radical livre é gerado e esta reação é inibida pela adição do composto ou amostra, que é objeto da medida da capacidade antioxidante (ALONSO et al., 2002).

As propriedades antioxidantes dos polifenóis por sua alta reatividade com o hidrogênio ou com doadores de elétrons são devido a sua habilidade de estabilizar e deslocar um elétron não pareado de radicais derivados dos polifenóis alterando a posição e seu potencial de quelar íons metais, ou seja, término da reação de Fenton (CHANDA; DAVE, 2009).

capacidade sequestradora de radicais livres do derivado tiofênico 6CN, houve uma significativa atividade sequestradora do derivado. O mesmo foi verificado ao determinar a capacidade antioxidante equivalente ao trolox (CAET) do 6CN ao obter-se um potencial antioxidante nesse teste. Nos dois testes o 6CN apresentou CE50˂ 500µg/mL. Vários estudos mostram que derivados tiofênicos apresentam atividade antioxidante, no entanto os estudos foram feitos por outras metodologias (MEOTTI et al., 2003; FERREIRA et al., 2006; SINGH et al., 2007).