DETERMINAÇÃO DA ESPECIFICIDADE DOS ANTICORPOS

Com o intuito de refinar a resposta dos anticorpos induzidos a partir da vacinação com as proteínas PvAMA-1, os anticorpos induzidos a partir da vacinação com as proteínas PvAMA-1 de forma individual foram testados contra as proteínas PvAMA-1, PvAMA1-Belem, PvAMA1-Sal-I, PvAMA1-PNG_62_MU, PvAMA1- Chesson-I, PvAMA1-Indonesia-XIX e PvAMA1-SK0814-apical (Figura 16). Em A, ao avaliarmos os resultados obtidos, para os anticorpos induzidos pelas proteínas PvAMA- 1, PvAMA1-Belem, PvAMA1-Sal-I e PvAMA1-PNG_62_MU quando comparadas entre si não foram observadas diferenças estatísticas (p<0,05). Em B, observamos a ausência de diferença estatística (p<0,05) ao compararmos os títulos de anticorpos induzidos pelas proteínas PvAMA-1 e PvAMA1-Chesson-I entre si, assim como pelas proteínas PvAMA1-Indonesia-XIX e PvAMA1-SK0814-apical entre si, no entanto quando comparamos os títulos de anticorpos induzidos pelas proteínas PvAMA-1 e PvAMA1-Chesson-I com os títulos de anticorpos induzidos pelas proteínas PvAMA1- Indonesia-XIX e PvAMA1-SK0814-apical a significante prevalência (p<0,001) é observada.

G1 G2 G3 G4 G5 4 6 8 ns G1 - PBS + Poly(I:C) G2 - PvAMA-1 +Poly(I:C) G3 - PvAMA1-Belem + Poly(I:C) G4 - PvAMA1-Sal-I + Poly(I:C) G5 - PvAMA1-PNG_62_MU + Poly(I:C) Contra PvAMA-1 Contra PvAMA1-Belem Contra PvAMA1-Sal-I Contra PvAMA1-Chesson-I Contra PvAMA1-PNG_62_MU Contra PvAMA1-Indonesia-XIX Contra PvAMA1-SK0814-apical T ít u lo s d e a n tic o rp o s a n ti- P v A M A e s p e c íf ic o s in d u z id o s e m c a m u n d o n g o s C5 7 B L /6 ( lo g 10 ) + /- S E M G1 G2 G6 G7 G8 4 6 8 ns ns *** G1 - PBS + Poly(I:C) G2 - PvAMA-1 + Poly(I:C) G6 - PvAMA1-Chesson-I + Poly(I:C) G7 - PvAMA1-Indonesia-XIX + Poly(I:C) G8 - PvAMA1-SK0814-apical + Poly(I:C) Contra PvAMA1-Belem Contra PvAMA1-Sal-I Contra PvAMA1-Chesson-I Contra PvAMA1-PNG_62_MU Contra PvAMA1-Indonesia-XIX Contra PvAMA1-SK0814-apical Contra PvAMA-1 T ít u lo s d e a n tic o rp o s a n ti- P v A M A e s p e c íf ic o s in d u z id o s e m c a m u n d o n g o s C 5 7 B L /6 ( lo g10 ) + /- S E M A B

Figura 16: Os anticorpos anti-PvAMA-1 reconhecem as variantes alélicas de PvAMA-1. Os

anticorpos anti-PvAMA-1 induzidos em camundongos C57BL/6 foram testados contra as novas proteínas recombinantes PvAMA-1. Os resultados estão expressos como média aritmética dos títulos de anticorpos de cada grupo em log10+SEM, foram estatisticamente comparados usando One-Way ANOVA seguido por

Tukey test para eventos múltiplos. As diferenças significativas estão destacadas no gráfico: *** (p<0,001). As diferenças não significativas (ns) estão destacadas no gráfico (p>0,05)

5 DISCUSSÃO

A Organização Mundial da Saúde (OMS) tem se empenhado na eliminação e controle dos casos de malária nos países os quais a doença se encontra. Avanços foram obtidos nos últimos anos, mas há muito a ser feito. Vacinas são uma estratégia promissora para alcançarmos a eliminação da doença, a vacina RTS,S, registrada como Mosquirix™ da fabricante GSK, voltada para proteção na infecção por P. falciparum, estágio pré-eritrocítico, chegou ao topo das pesquisas e hoje está cotada no programa piloto da OMS para implementação da vacina, previsto para começar neste ano de 2018 (CLEMENS; MOORTHY, 2016; WHO, 2017b). Para P. vivax não temos ainda uma formulação vacinal que tenha alcançado tal estágio.

No presente trabalho, geramos, caracterizamos e avaliamos a imunogenicidade de seis novas variantes alélicas baseadas na PvAMA-1, com base no estudo global de populações da proteína PvAMA-1 (ARNOTT et al., 2013). Foi possível gerar as novas proteínas recombinantes PvAMA1-Belem, PvAMA1-Sal-I, PvAMA1-Indonesia-XIX, PvAMA1-SK0814-apical, PvAMA1-PNG_62_MU e PvAMA1-Chesson-I com sucesso. O resultado obtido para o ensaio de immunoblotting confirma a expressão das proteínas PvAMA-1. Os resultados obtidos a partir da análise de dicroísmo circular mostram variação nos resultados encontrados para cada uma das proteínas, as proteínas PvAMA1-Indonesia-XIX, PvAMA1-Belem, PvAMA1-Chesson-I, PvAMA1-Indonesia- XIX e PvAMA1-SK0814-apical apresentaram predomínio de folhas beta, tais achados corroboram com os resultados encontrados em estudos anteriores (LIMA, 2014; ROCHA et al., 2017; VICENTIN et al., 2014) assim como os resultados obtidos a partir da análise da estrutura cristalográfica de PvAMA-1 cepa SalI feita por Pizarro e colaboradores (2005). As proteínas PvAMA1-Sal-I e PvAMA1-PNG_62_MU apresentaram uma pequena variação na predição de estruturas secundárias, as estruturas α-hélix apresentaram aumento comparado aos dados encontrados nos estudos anteriores mencionados.

Uma análise inicial da imunogenicidade da nova proteína PvAMA1-Chesson-I sob diferentes concentrações foi performada a fim de avaliar a resposta para doses vacinais contendo 1, 5 ou 10µg da proteína recombinante por dose. Os títulosde anticorpos IgG induzidos a partir do regime de imunização com três doses vacinais no intervalo de 21 dias, mostrou a significativa prevalência (p<0,01) entre o grupo que

recebeu a dose contendo 10µg de proteína recombinante para com os demais. A dose de 10µg de proteína foi estabelecida com base neste ensaio e também nos experimentos conduzidos em trabalhos anteriores do grupo utilizando o adjuvante Poly(I:C) (CASALE, 2013; LIMA, 2014; PEREIRA, 2012; ROCHA et al., 2017).

Para a avaliação da imunogenicidade das novas proteínas PvAMA-1, PvAMA1- Belem, PvAMA1-Sal-I, PvAMA1-Chesson-I, PvAMA1-PNG_62_MU, PvAMA1- SK0814-apical e PvAMA1-Indonesia-XIX, a concentração final de 10µg de proteína recombinante por dose, na formulação individual e 2µg de cada uma das proteínas na combinação equimolar, foi adotada seguindo o observado no ensaio curva dose resposta assim como nos estudos que utilizam a abordagem multi alélica para PfAMA-1 (KUSI et al., 2009). A análise do desempenho individual para cada nova proteína recombinante, mostrou que os resultados obtidos a partir da indução de títulos de anticorpos IgG para as novas proteínas PvAMA1-Belem, PvAMA1-PNG_62_MU são equiparáveis aos resultados observados para a PvAMA-1 expressa e avaliada anteriormente pelo grupo (VICENTIN et al., 2014), e utilizada como controle para análise da resposta das novas proteínas PvAMA-1. A vacinação com as proteínas PvAMA1-Sal-I, PvAMA1-Chesson-I, PvAMA1-Indonesia-XIX e PvAMA1-SK0814- apical apresentaram diferença significativa nos títulos obtidos em comparação com os demais grupos.

Os resultados observados a partir da vacinação utilizando a combinação equimolar das novas proteínas PvAMA-1 demonstrou que as novas proteínas PvAMA1- Belem, PvAMA1-Sal-I, PvAMA1-PNG_62_MU e PvAMA1-Chesson-I atuaram bem quando administradas no mix vacinal apresentando títulos equiparáveis aos obtidos para a proteína PvAMA-1 e aos títulos obtidos para vacinação homóloga. Este dado corrobora com um estudo anterior em PfAMA-1, onde num ensaio utilizando três variantes alélicas de PfAMA-1 em combinação equimolar, os resultados obtidos a partir da vacinação de coelhos demonstrou que os títulos de anticorpos induzidos a partir da vacinação com o mix e apresentou títulos similares aos obtidos na vacinação homóloga, com a vantagem da formulação mix e de utilizar 1/3 de cada variante alélica por dose (KUSI et al., 2009). A proteína PvAMA1-Sal-I teve seu título de anticorpos induzidos reduzidos na abordagem da combinação equimolar enquanto apresentando a significativa prevalência p<0,001 quando comparada com as proteínas PvAMA-1, PvAMA1-Belem e PvAMA1-PNG_62_MU. A significativa prevalência p<0,001 foi

observada quando comparamos os títulos de anticorpos induzidos pela combinação equimolar para a proteína PvAMA1-Indonésia-XIX com as proteínas PvAMA-1, PvAMA1-Belem e PvAMA1-PNG_62_MU. A significativa prevalência p<0,001 foi observada também quando comparamos os títulos de anticorpos induzidos pela combinação equimolar para a proteína PvAMA1-SK0814-apical para para com os títulos de anticorpos induzidos a para as demais proteínas

O número de variantes alélicas requeridos para uma formulação multi gênica que venha a cobrir o polimorfismo de AMA-1 é um assunto em discussão, visto o número de variantes disponíveis, o estudo entre as similaridades e o potencial antigênico das proteínas recombinantes baseadas nos antígenos AMA-1 é necessário para uma melhor abordagem utilizando a combinação equimolar de variantes alélicas baseadas no antígeno AMA-1. Baseado no estudo do fenômeno de diluição do epítopo, EDiP, e sua aplicabilidade para antígenos polimórficos, com base em estudos publicados para AMA-1, uma vacina eficaz contra este antígeno requer no mínimo três variantes alélicas em sua formulação, indo de encontro aos recentes resultados positivos para formulação vacinal PfAMA-1 DiCo (KUSI et al., 2017; SIRIMA et al., 2017).

Um ensaio para avaliar a especificidade dos anticorpos obtidos para cada nova proteína recombinante foi performado e a ele adicionado a proteína PvAMA-1. Os resultados observados para os grupos PvAMA-1, PvAMA1-Belem, PvAMA1- PNG_62_MU, PvAMA1-Sal-I e PvAMA1-Chesson-I diferenças estatísticas significativas (p<0,05) não foram observadas ao compararmos o desempenho de reconhecimento para cada proteína. Os anticorpos induzidos a partir da vacinação com as proteínas PvAMA1-Indonesia-XIX e PvAMA1-SK0814-apical foram capazes de reconhecer todas as proteínas utilizadas no ensaio, porém os títulos obtidos apresentaram a significativa prevalência p<0,001 quando as comparamos com os títulos de anticorpos induzidos pela proteína PvAMA-1. A resposta cruzada entre as variantes alélicas observadas no presente estudo, é um dado bastante positivo, considerando que estudos em PfAMA-1 com análise multigênica sustentam a abordagem multi alélica em PfAMA-1 e a reatividade cruzada é uma aliada na busca por uma formulação eficiente contendo um número limitado de variantes alélicas na formulação vacinal (CHAUDHURY; REIFMAN; WALLQVIST, 2014; DUTTA et al., 2013; TERHEGGEN et al., 2014).

6. CONCLUSÃO

I. As novas proteínas recombinantes PvAMA1-Belem, PvAMA1-Sal-I, PvAMA1- Chesson-I, PvAMA1-PNG_62_MU, PvAMA1-SK0814-apical e PvAMA1- Indonesia-XIX foram expressas com sucesso utilizando leveduras P. pastoris, na forma de proteínas solúveis, puras e com bom rendimento.

II. As novas proteínas recombinantes baseadas em PvAMA-1 demonstraram-se imunogênicas na presença do adjuvante Poly(I:C). Quando utilizadas em combinação equimolar, apresentaram significativa prevalência p<0,001 entre os títulos de anticorpos induzidos para as proteínas PvAMA-1, PvAMA1-Belem e PvAMA1-PNG_62_MU para com os títulos induzidos para as demais proteínas.

III. A análise da resposta cruzada entre as proteínas PvAMA-1 utilizadas no presente estudo, apresentou a significativa prevalência p<0,001 para as proteínas PvAMA1-Indonesia-XIX e PvAMA1-SK0814-apical quando comparadas as demais proteínas avaliadas neste estudo.

IV. Em conjunto, os dados obtidos a partir do presente estudo demonstram que a utilização de múltiplas variantes alélicas pode ser uma boa estratégia vacinal, porém a análise e interpretação da resposta imune induzida pela vacinação é dificultada pela complexidade individual das moléculas utilizadas no estudo. Mais estudos são necessários para a predição correta de uma combinação equimolar eficaz universal contra PvAMA-1.

REFERÊNCIAS

ACQUAH, F. K. et al. Antibody responses to two new Lactococcus lactis-produced recombinant

Pfs48/45 and Pfs230 proteins increase with age in malaria patients living in the Central Region of Ghana.

Malaria Journal, v. 16, n. 1, p. 306, 1 dez. 2017.

AGNANDJI, S. T. et al. First results of phase 3 trial of RTS,S/AS01 malaria vaccine in African children.

The New England journal of medicine, v. 365, n. 20, p. 1863–75, 17 nov. 2011.

AGNANDJI, S. T. et al. A phase 3 trial of RTS,S/AS01 malaria vaccine in African infants. The New

England journal of medicine, v. 367, n. 24, p. 2284–95, 13 dez. 2012.

ARNOTT, A. et al. Global Population Structure of the Genes Encoding the Malaria Vaccine Candidate, Plasmodium vivax Apical Membrane Antigen 1 (PvAMA1). PLoS neglected tropical diseases, v. 7, n. 10, p. e2506, jan. 2013.

ARNOTT, A. et al. Distinct patterns of diversity, population structure and evolution in the AMA1 genes of sympatric Plasmodium falciparum and Plasmodium vivax populations of Papua New Guinea from an area of similarly high transmission. Malaria journal, v. 13, p. 233, 2014.

ASHLEY, E. A.; PYAE PHYO, A.; WOODROW, C. J. Malaria. The Lancet, v. 391, n. 10130, p. 1608– 1621, 21 abr. 2018.

BABON, J. J. et al. Structural studies on Plasmodium vivax merozoite surface protein-1. Molecular and

biochemical parasitology, v. 153, n. 1, p. 31–40, maio 2007.

BAI, T. et al. Structure of AMA1 from Plasmodium falciparum reveals a clustering of polymorphisms that surround a conserved hydrophobic pocket. Proceedings of the National Academy of Sciences of

the United States of America, v. 102, n. 36, p. 12736–41, 6 set. 2005.

BAKER, D. A. Malaria gametocytogenesis. Molecular and Biochemical Parasitology, v. 172, n. 2, p. 57–65, 1 ago. 2010.

BARGIERI, D. Y. et al. New malaria vaccine candidates based on the Plasmodium vivax Merozoite Surface Protein-1 and the TLR-5 agonist Salmonella Typhimurium FliC flagellin. Vaccine, v. 26, n. 48, p. 6132–6142, 2008.

BHARDWAJ, R. et al. Production of recombinant PvDBPII, receptor binding domain of Plasmodium vivax Duffy binding protein, and evaluation of immunogenicity to identify an adjuvant formulation for vaccine development. Protein Expression and Purification, 2015.

BIRKETT, A. J. PATH Malaria Vaccine Initiative (MVI): perspectives on the status of malaria vaccine development. Human vaccines, 2010.

BIRKETT, A. J. Status of vaccine research and development of vaccines for malaria. Vaccine, v. 34, n. 26, p. 2915–2920, 2016.

BITENCOURT, A. R. et al. Antigenicity and immunogenicity of Plasmodium vivax merozoite surface protein-3. PloS one, v. 8, n. 2, p. e56061, 2013.

BLAGBOROUGH, A. M. et al. Transmission blocking potency and immunogenicity of a plant-produced Pvs25-based subunit vaccine against Plasmodium vivax. Vaccine, v. 34, n. 28, p. 3252–3259, 14 jun. 2016.

BÖHM, G.; MUHR, R.; JAENICKE, R. Quantitative analysis of protein far UV circular dichroism spectra by neural networks. Protein Eng., v. 5, n. 3, p. 191–195, 1992.

CASALE, P. A. O. Caracterização da resposta imune celular induzida pela imunização experimental com antígenos recombinantes de Plasmodium vivax Patricia Ostermayer Athayde Casale Caracterização da resposta imune celular induzida pela imunização experimental com antígenos. p. 100, 2013.

CHAUDHURY, S.; REIFMAN, J.; WALLQVIST, A. Simulation of B cell affinity maturation explains enhanced antibody cross-reactivity induced by the polyvalent malaria vaccine AMA1. Journal of

immunology (Baltimore, Md. : 1950), v. 193, n. 5, p. 2073–86, 2014.

CHESNE-SECK, M.-L. et al. Structural comparison of apical membrane antigen 1 orthologues and paralogues in apicomplexan parasites. Molecular and Biochemical Parasitology, v. 144, n. 1, p. 55–67, 2005.

CLEMENS, J.; MOORTHY, V. Implementation of RTS,S/AS01 Malaria Vaccine — The Need for Further Evidence. New England Journal of Medicine, v. 374, n. 26, p. 2596–2597, 30 jun. 2016. CRAWFORD, J. et al. Structural characterization of apical membrane antigen 1 (AMA1) from Toxoplasma gondii. The Journal of biological chemistry, v. 285, n. 20, p. 15644–52, 14 maio 2010. DATTA, D. et al. Comparative functional potency of DNA vaccines encoding Plasmodium falciparum transmission blocking target antigens Pfs48/45 and Pfs25 administered alone or in combination by in vivo electroporation in rhesus macaques. Vaccine, v. 35, n. 50, p. 7049–7056, 15 dez. 2017.

DE CAMARGO, T. M. et al. Prime-boost vaccination with recombinant protein and adenovirus-vector expressing Plasmodium vivax circumsporozoite protein (CSP) partially protects mice against Pb/Pv sporozoite challenge. Scientific reports, v. 8, n. 1, p. 1118, 18 jan. 2018.

DRAPER, S. J. et al. Recent advances in recombinant protein-based malaria vaccines. Vaccine, v. 33, n. 52, p. 7433–7443, 22 dez. 2015.

DREW, D. R. et al. Defining the Antigenic Diversity of Plasmodium falciparum Apical Membrane Antigen 1 and the Requirements for a Multi-Allele Vaccine against Malaria. PLoS ONE, v. 7, n. 12, p. e51023, 5 dez. 2012.

DREW, D. R. et al. Functional Conservation of the AMA1 Host-Cell Invasion Ligand Between P. falciparum and P. vivax: A Novel Platform to Accelerate Vaccine and Drug Development. The Journal

DUTTA, S. et al. Overcoming antigenic diversity by enhancing the immunogenicity of conserved epitopes on the malaria vaccine candidate apical membrane antigen-1. PLoS pathogens, v. 9, n. 12, p. e1003840, 2013.

DZIKOWSKI, R.; FRANK, M.; DEITSCH, K. Mutually Exclusive Expression of Virulence Genes by Malaria Parasites Is Regulated Independently of Antigen Production. PLoS Pathogens, v. 2, n. 3, p. e22, 2006.

ELIAS, S. C. et al. Analysis of human B-cell responses following ChAd63-MVA MSP1 and AMA1 immunization and controlled malaria infection. Immunology, v. 141, n. 4, p. 628–44, abr. 2014. EPSTEIN, J. E. et al. Protection against Plasmodium falciparum malaria by PfSPZ Vaccine. JCI insight, v. 2, n. 1, p. e89154, 12 jan. 2017.

FERREIRA, M. U.; CASTRO, M. C. Challenges for malaria elimination in BrazilMalaria Journal, 2016.

FRIED, M.; DUFFY, P. E. Designing a VAR2CSA-based vaccine to prevent placental malaria. Vaccine, v. 33, n. 52, p. 7483–7488, 22 dez. 2015.

GALINSKI, M. R.; BARNWELL, J. W. Plasmodium vivax: who cares? Malaria journal, v. 7 Suppl 1, p. S9, jan. 2008.

GAUR, DEEPAK, ET. AL. Advances in Malaria Research. [s.l: s.n.].

GENTIL, F. et al. A recombinant vaccine based on domain II of Plasmodium vivax Apical Membrane Antigen 1 induces high antibody titres in mice. Vaccine, v. 28, n. 38, p. 6183–6190, 2010.

GIMENEZ, A. M. et al. Vaccine Containing the Three Allelic Variants of the Plasmodium vivax Circumsporozoite Antigen Induces Protection in Mice after Challenge with a Transgenic Rodent Malaria Parasite. Frontiers in immunology, v. 8, p. 1275, 2017.

GOOD, M. F.; MILLER, L. H. Interpreting challenge data from early phase malaria blood stage vaccine trials. Expert Review of Vaccines, v. 17, n. 3, p. 189–196, 2018.

GOUY, M.; GUINDON, S.; GASCUEL, O. SeaView Version 4: A Multiplatform Graphical User Interface for Sequence Alignment and Phylogenetic Tree Building. Molecular Biology and Evolution, v. 27, n. 2, p. 221–224, 1 fev. 2010.

GRYNBERG, P.; FONTES, C. J. F.; BRAGA, É. M. Association between particular polymorphic residues on apical membrane antigen 1 (AMA-1) and platelet levels in patients with vivax malaria.

Clinical Microbiology and Infection, v. 13, n. 11, p. 1089–1094, 2007.

GUY, A. J. et al. Structural patterns of selection and diversity for Plasmodium vivax antigens DBP and AMA1. Malaria journal, v. 17, n. 1, p. 183, 2 maio 2018.

HOFFMAN, S. L. et al. The March Toward Malaria Vaccines. American journal of preventive

INVITROGEN, L. T. C. U. I. Vector for Multicopy Integration and Secreted Expression. [s.l: s.n.]. JIANG, J. et al. Plasmodium vivax merozoite surface protein-3 (PvMSP3): expression of an 11 member multigene family in blood-stage parasites. PloS one, v. 8, n. 5, p. e63888, jan. 2013.

JOSLING, G. A.; LLINÁS, M. Sexual development in Plasmodium parasites: knowing when it’s time to commit. Nature Reviews Microbiology, v. 13, n. 9, p. 573–587, 14 ago. 2015.

KASTILAN, R. et al. Improvement of a fermentation process for the production of two PfAMA1-DiCo- based malaria vaccine candidates in Pichia pastoris. Scientific reports, v. 7, n. 1, p. 11991, 20 set. 2017. KUSI, K. A. et al. Humoral Immune Response to Mixed PfAMA1 Alleles; Multivalent PfAMA1 Vaccines Induce Broad Specificity. PLoS ONE, v. 4, n. 12, p. e8110, 1 dez. 2009.

KUSI, K. A. et al. Generation of humoral immune responses to multi-allele PfAMA1 vaccines; effect of adjuvant and number of component alleles on the breadth of response. PloS one, v. 5, n. 11, p. e15391, 2010.

KUSI, K. A. et al. Safety and immunogenicity of multi-antigen AMA1-based vaccines formulated with CoVaccine HTTM _{and Montanide ISA 51 in rhesus macaques. Malaria journal, v. 10, p. 182, 2011a.}

KUSI, K. A. et al. Immunization with different PfAMA1 alleles in sequence induces clonal imprint humoral responses that are similar to responses induced by the same alleles as a vaccine cocktail in rabbits. Malaria journal, v. 10, p. 40, 14 fev. 2011b.

KUSI, K. A. et al. EDiP: the Epitope Dilution Phenomenon. Lessons learnt from a malaria vaccine antigen and its applicability to polymorphic antigens. Expert Review of Vaccines, p. 1–9, 11 dez. 2017. LIMA, L. C. Avaliação da imunogenicidade de proteínas recombinantes baseadas em antígenos de

diferentes estágios do Plasmodium vivax expressos em Pichia pastoris. [s.l: s.n.].

LUZZATTO, L.; SENECA, E. G6PD deficiency: a classic example of pharmacogenetics with on-going clinical implications. British Journal of Haematology, v. 164, n. 4, p. 469–480, 1 fev. 2014.

MAIGA, B. et al. Human candidate polymorphisms in sympatric ethnic groups differing in malaria susceptibility in Mali. PloS one, v. 8, n. 10, p. e75675, 2013.

MINISTÉRIO DA SAÚDE. Guia prático de tratamento da malária no Brasil Guia prático de

tratamento da malária no Brasil. [s.l: s.n.].

MINISTÉRIO DA SAÚDE. GUIA DE VIGILÂNCIA EM SAÚDE. 1a edição ed. Brasília, DF: Ministério da Saúde, 2017. v. 3

MONTERO, E. et al. Babesia divergens: identification and characterization of BdHSP-20, a small heat shock protein. Experimental parasitology, v. 119, n. 2, p. 238–45, jun. 2008.

MORAIS, C. G. et al. Antibodies to Plasmodium vivax apical membrane antigen 1: persistence and correlation with malaria transmission intensity. The American journal of tropical medicine and

hygiene, v. 75, n. 4, p. 582–7, out. 2006.

MUELLER, I.; SHAKRI, A. R.; CHITNIS, C. E. Development of vaccines for Plasmodium vivax malaria. Vaccine, v. 33, p. 7489–7495, 2015.

MÚFALO, B. C. et al. Plasmodium vivax apical membrane antigen-1: comparative recognition of different domains by antibodies induced during natural human infection. Microbes and Infection, v. 10, p. 1266–1273, 2008.

NTUMNGIA, F. B. et al. A Novel Erythrocyte Binding Protein of Plasmodium vivax Suggests an Alternate Invasion Pathway into Duffy-Positive Reticulocytes. mBio, v. 7, n. 4, p. e01261-16, 23 set. 2016.

PEREIRA, M. D. O. Análise da resposta imune induzida pela imunização experimental com antígenos recombinantes de Plasmodium vivax. 2012.

PHILLIPS, M. A. et al. Malaria. 2017.

PIZARRO, J. C. et al. Crystal structure of the malaria vaccine candidate apical membrane antigen 1.

Science (New York, N.Y.), v. 308, n. 5720, p. 408–11, 15 abr. 2005.

PRUDÊNCIO, M.; RODRIGUEZ, A.; MOTA, M. M. The silent path to thousands of merozoites: the Plasmodium liver stage. Nature Reviews Microbiology, v. 4, n. 11, p. 849–856, nov. 2006.

RAMOS, C. H. I. A spectroscopic-based laboratory experiment for protein conformational studies*.

Biochemistry and molecular biology education : a bimonthly publication of the International Union of Biochemistry and Molecular Biology, v. 32, n. 1, p. 31–4, 2004.

REMARQUE, E. J. et al. Apical membrane antigen 1: a malaria vaccine candidate in review. Trends in

Parasitology, v. 24, n. 2, p. 74–84, 2008.

ROCHA, M. V. et al. Generation, characterization and immunogenicity of a novel chimeric recombinant protein based on Plasmodium vivax AMA-1 and MSP119. Vaccine, v. 35, n. 18, p. 2463–2472, 25 abr. 2017.

RODRIGUES, M. H. C. et al. Antibody response of naturally infected individuals to recombinant Plasmodium vivax apical membrane antigen-1. International Journal for Parasitology, v. 35, n. 2, p. 185–192, 2005.

ROOBSOONG, W. The In Vitro Invasion Inhibition Assay (IIA) for Plasmodium vivax. In: [s.l.] Humana Press, New York, NY, 2015. p. 187–196.

SALMAN, A. M. et al. Rational development of a protective P. vivax vaccine evaluated with transgenic rodent parasite challenge models. Scientific reports, v. 7, p. 46482, 18 abr. 2017.

SIRIMA, S. B. et al. Safety and immunogenicity of a recombinant Plasmodium falciparum AMA1-DiCo malaria vaccine adjuvanted with GLA-SE or Alhydrogel® in European and African adults: A phase 1a/1b, randomized, double-blind multi-centre trial. Vaccine, v. 35, n. 45, p. 6218–6227, 27 out. 2017.

SIRIMA, S. B.; COUSENS, S.; DRUILHE, P. Protection against malaria by MSP3 candidate vaccine.

The New England journal of medicine, v. 365, n. 11, p. 1062–4, 15 set. 2011.

SISSOKO, M. S. et al. Safety and efficacy of PfSPZ Vaccine against Plasmodium falciparum via direct venous inoculation in healthy malaria-exposed adults in Mali: a randomised, double-blind phase 1 trial.

The Lancet Infectious Diseases, v. 17, n. 5, p. 498–509, 1 maio 2017.

SRINIVASAN, P. et al. Binding of Plasmodium merozoite proteins RON2 and AMA1 triggers