Determinação da proporção dos plasmídeos na co-transfecção

Para a produção de vetores lentivirais baseados no HIV foi necessária a co-transfecção de três plasmídeos necessários à formação da partícula viral), além do plasmídeo de interesse que codifica o gene para a superexpressão do miRNA e um gene-repórter RFP (Red

Fluorescence Protein) (vetores: CD516B-scramble; CD516B-mir-221; CD516B-mir-222 e

CD516B-mir-4728-3p), conforme descrito nos Materiais e Métodos deste Capítulo. Portanto, foi necessária a determinação da proporção dos plasmídeos de interesse e da mistura dos 3 plasmídeos de formação da partícula viral (pPACKH1). Para isso, foi empregado o plasmídeo utilizado como controle positivo, pSIH1-H1-siLuc-copGFP, presente no kit adquirido.

Inicialmente, foram testadas relações de plasmídeo controle positivo : pPACKH1 nas proporções 1:6 e 1:4. Os resultados foram avaliados por microscopia de fluorescência capturadas em 48h após a co-transfecção. Imagens fotográficas registrando estes resultados (em luz visível e em fluorescência) são apresentadas a segir (Figura 23).

Figura 23 – Imagens fotográficas por microscopia em luz visível e UV da linhagem celular 293T/17 48h após a co-transfecção do plasmídeo controle positivo pSIH1-H1-siLuc-copGFP : pPACKH1 em diferentes proporções. (A) 1:6 (B) 1:4 (C) Controle negativo.

Os resultados indicaram maior intensidade de fluorescência em células co- transfectadas na proporção 1:4 em 48h após a co-transfecção. A partir de 24h após a co- transfecção foram observadas alterações na morfologia celular para um aspecto arredondado, além da presença de sincício, que é resultado indicador de fusão celular resultante de replicação viral, efeitos observados nas duas proporções de plasmídeos testadas.

A fim de verificar o efeito da co-transfecção dos plasmídeos e, posteriormente, o efeito da transdução dos mesmos nas células de interesse, foram realizadas co-transfecções com o plasmídeo CD516B-mir-222, o qual possui maior tamanho em relação aos demais plasmídeos de interesse, inclusive em relação ao plasmídeo controle positivo pSIH1-H1- siLuc-copGFP.

A partir desse experimento, observou-se, além da expressão de RFP, alteração da morfologia celular com a presença de sincícios e grande desprendimento de células 293T/17, principalmente 72h após a co-transfecção (tempo no qual coletou-se o sobrenadante para a transdução viral nas células de interesse). A transdução nas células-alvo, não ocorreu após ser usado o protocolo original da empresa SBI. Portanto, houve a necessidade de padronização da técnica.

A fim de evitar o desprendimento de células 293T/17 e determinar qual o tempo do ponte de coleta com maior número de partículas virais viáveis, co-transfecções foram testadas na presença ou ausência de poli-lisina, além de duas diferentes proporções de plasmídeos (CD516B-mir-222: pPACKH1, 1:2 e 1:4) e diferentes tempos de coleta (24, 48 e 72h), conforme Figura 24.

Figura 24 – Imagens fotográficas por microscopia em luz visível e UV da linhagem celular 293T/17 após a co-transfecção dos plasmídeos CD516B-mir-222 : pPACKH1 em diferentes proporções, na ausência ou presença de poli-lisina em diferentes tempos. Presença de poli-lisina (A, C, E, G, I, K) ou ausência (B, D, F, H, J, L). Fotografia foram feitas 24h (A-D) 48h (E-H) ou 72h (I-L) após a tranfecção. As proporções usadas dos plasmídeos CD516B-mir-222 : pPACKH1 foram 1:2 (A-B, E-F, I-J) ou 1:4 (C-D, G-H, K-L).

A partir desses resultados mostrados acima (Figura 24), foi possível observar que a presença da poli-lisina evitou o grande desprendimento de células, principalmente nos pontos de 48 e 72h após a co-transfecção. As proporções 1:2 e 1:4 entre plasmídeos CD516B-mir- 222 : pPACKH1 não apresentaram diferenças aparentes, porém os tempos de 24, 48 e 72h apresentaram diferenças significativas em relação ao desprendimento e morte celular. Portanto, a fim de verificar a influência dos diferentes tempo de coleta do sobrenadante no título viral, a etapa de determinação da titulação viral foi realizada.

3.3.3.2 Titulação viral

As titulações virais foram feitas por qRT-PCR utilizando o kit UltraRapid Lentiviral

Titer (SBI), que contém um iniciador universal (WPRE) para qualquer construto baseado em

HIV proveniente da SBI e um outro iniciador universal (UCR1) utilizado como uma referência interna para o cálculo do MOI.

Para determinar os MOIs das amostras foram utilizados gDNAs derivados de células 293T/17 transduzidas com sobrenadantes contendo partículas virais coletadas 24, 48 e 72h após a infecção. Os pontos da curva de calibração foram amplificados simultaneamente com as nossas amostras. A curva de calibração (Figura 25) mostra a correlação entre os valores de MOI das amostras fornecidas pelo fabricante e os valores 2-ΔCT de cada amostra obtidos na reação, onde ΔCt = Ct WPRE – Ct UCR1. Para determinar o valor de MOI e, posteriormente o número de partículas virais presentes nos sobrenadantes analisados, foi utilizada a equação da reta (y = ax + b) obtida a partir curva de calibração, onde y é o valor de MOI a ser determinado para cada amostra e x o valor dado por 2-ΔCT de cada amostra analisada (y = 0,4075 multiplicado pelo valor de 2-ΔCT). A partir da determinação dos valores de MOI dos sobrenadantes foi possível determinar a concentração de partículas virais (IFU/mL) presentes nos sobrenadantes através da seguinte equação: (MOIamostra) x (número de células utilizados no momento da transdução) x 1000/µl de sobrenadante contendo partículas virais para a transdução. As concentrações de partículas virais obtidas nos sobrenadantes de 24, 48 e 72h foram, respectivamente, 8.71x106, 12.6x106 e 0.136x106 IFU/mL.

Figura 25 - Curva de calibração para titulação viral. No eixo x: valores de 2-ΔCT e no eixo y: valores de MOI, equação da reta (y = 0,4075x) e R2 _{(coeficiente de correlação). Da esquerda para a direita temos:}

ponto 1 (MOI 0; 2-ΔCT_{: 0,16), ponto 2 (MOI 0.52; 2}-ΔCT_{: 1,46), ponto 3 (MOI 1.22; 2}-ΔCT_{: 2,22),}

3.3.3.3 Transdução viral nas células-alvo

Para a transdução das partículas virais nas células-alvo foram utilizados diferentes volumes (10, 20, 50 e 100 µL) de sobrenadante do ponto de coleta de 48h após a co- transfecção, uma vez que este apresentou maior concentração de partículas virais. Além disso, o sobrenadante deste mesmo ponto mostrou maior expressão do gene-repórter (RFP) sem sinais de morte celular (Figura 26). As linhagens MCF-7, SKBR3 e BT-474 foram transduzidas com 10 µL de sobrenadante contendo lentivetores para a superexpressão de miR- 221, -222 e -4728-3p e co-expressão o gene-repórter RFP (Figura 26).

Figura 26 - Imagens fotográficas por microscopia em luz visível e UV linhagens celulares MCF-7,

BT-474 e SKBR3 transduzidas com lentivetores para a superexpressão de miR-221, - 222 e 4728-3p e RFP.

A partir das observações no microscópio de fluorescência foi possível notar que a eficiência da transdução com 10 µL de sobrenadante não foi 100% nas 3 linhagens transduzidas com os 4 plasmídeos. Isso leva a uma maior probabilidade de apenas 1 DNA viral ter se inserido no DNA genômico das células-alvo. Através dos cálculos de MOI, considerando o volume de sobrenadante utilizado, o número de células plaqueadas, o título viral uma a eficiência de transdução menor que 100% com pouca variação entre as linhagens, foi possível estimar o valor de MOI menor que 10 para todas as transduções realizadas acima (Figura 26).