Determinação de atividade da maltase

O princípio do método baseia-se na capacidade da maltase em hidrolisar oligossacarídeos como maltose e sacarose (que são formados por glicose ligada em ligação α a outro monossacarídeo) ou substratos sintéticos como o pNPαG (que são formados por glicose ligada a um grupo fenólico, através de ligação osídica em conformação “α”. Em S. cerevisiae, a maltase é uma enzima intracelular (citoplasmática), que possui pH ótimo próximo de 6,8. Há relatos da existência de outros tipos α-glicosidase (TESTE; FRANÇOIS; PARROU, 2010), porém não se tem muito conhecimento sobre as características dos demais tipos dessa enzima.

A atividade de hidrólise da maltase foi avaliada utilizando-se células permeabilizadas com tolueno, etanol e triton X-100, e maltose, sacarose e pNPαG como substratos. Para calcular a atividade de hidrólise, foram quantificados a glicose formada, no caso de utilização de carboidratos, e o p-nitrofenol formado, no caso de utilização do substrato sintético, conforme protocolo adaptado de Stambuk et al. (1999): Suspensões celulares das linhagens foram preparadas com água na concentração de 20 ± 1 g.L-1. Um volume de 100 µL da suspensão celular foi transferido para um (01) tubo Eppendorf, centrifugado por 3 min a 5.000 g e a parte líquida desprezada. Um volume de 500 µL de Tampão A (tampão 100mM MOPS-NaOH pH = 6,8) foi adicionado ao tubo, e após homogeneização, o tubo foi centrifugado por 3 min a 5.000 g e a parte líquida desprezada. Volumes de 200 µL, de Tampão B (20% de glicerol, 1mM de EDTA, 1mM de DTT e tampão 100mM MOPS-NaOH pH = 6,8) e de 12 µL, de Tampão C (tolueno P.A., etanol P.A. e triton X-100 10% em água, na proporção 1:4:1 – v:v:v) foram adicionados ao tubo, e após homogeneização por 1 minuto em agitador tipo Vortex, o tubo foi centrifugado por 3 min a 5.000 g, e a parte líquida

desprezada. Um volume de 1 mL de Tampão B foi adicionado ao tubo, e após homogeneização, o tubo foi centrifugado por 3 min a 5.000 g e a parte líquida desprezada (passo realizado 2x). Em seguida, um volume de 1 mL de Tampão A foi adicionado ao tubo, para formar uma suspensão de células permeabilizadas. Volumes de 50 µL, das suspensões de células permeabilizadas, foram transferidos para cinco (05) tubos Eppendorf, no intuito de fazer células amostras em triplicata e células controles em duplicata. As células permeabilizadas controle foram preparadas, incubando os tubos em Banho Maria a 100 °C por 10 min. Foi adicionado a cada tubo, um volume de 50 µL de Tampão Carboidrato (200mM de maltose ou de sacarose em tampão 100mM MOPS-NaOH pH = 6,8), ou, um volume de 950 µL de Tampão Sintético (2 mM de pNPαG e tampão 100mM MOPS-NaOH pH = 6,8). Nas análises com Tampão Carboidrato, os tubos foram incubados em Banho Maria a 30 °C por 5 min, enquanto que nas análises com Tampão Sintético, os tubos foram incubados em Banho Maria a 30 °C por 1 min. Após o término do tempo, os tubos foram rapidamente incubados em Banho Maria a 100 °C por 10 min, e em seguida, esfriados em banho de gelo por 5 min. Os tubos foram centrifugados por 3 min a 5.000 g, e nas análises com Tampão Carboidrato, a parte líquida (sobrenadante) foi utilizada para quantificar a glicose formada (conforme protocolo descrito no item 4.10.2), enquanto que nas análises com Tampão Sintético, um volume de 800 µL da parte líquida foi coletada, com auxílio de um pipetador, e a leitura de absorbância, das amostras e dos controles, foi realizada em espectrofotômetro com comprimento de onda a 400 nm. Nas análises com Tampão Carboidrato, a atividade de hidrólise foi calculada em função da concentração de glicose formada, por minuto e por miligrama de células permeabilizadas (através da equação 24), enquanto que nas análises com Tampão Sintético, a atividade de transporte foi calculada em função da concentração de p-nitrofenol formado, por minuto e por miligrama de células permeabilizadas (através da equação 25). Os valores de atividade foram expressos pela diferença, entre o valor médio de atividade das amostras, analisadas em triplicata, e o valor médio de atividade das células controle, analisadas em duplicata.

VMaltase Total Carboidrato = (AbsAmostra . 555) / (AbsPadrão . X . t) (24)

onde: VMaltase Total Carboidrato = Atividade de hidrólise em nmoles . mg-1 . min-1;

AbsPadrão = Absorbância em 505 nm do tubo padrão de glicose;

X = Concentração de biomassa celular, em mg, contida em 50 µL nos tubos; t = Tempo, em minutos, de reação.

V_{Maltase Total pNFαG} = [(AbsAmostra - AbsControle) . 1000] / (t . X . ∆ε) (25)

onde: V_{Maltase Total pNFαG} = Atividade de hidrólise em nmoles . mg-1 . min-1;

AbsAmostra = Absorbância em 400 nm do tubo amostra;

AbsControle = Absorbância em 400 nm do tubo controle;

t = Tempo, em minutos, de reação;

X = Concentração de biomassa celular, em mg, contida em 100 µL nos tubos; ∆ε = Coeficiente de Absortividade Molar (7,28 mM-1. cm-1, em pH > 6,8).

4.13 Determinação dos parâmetros fisiológicos

Os parâmetros fisiológicos das linhagens foram calculados na fase de crescimento exponencial, conforme descrito por Schmidell et al. (2001). Inicialmente, as fases de crescimento das linhagens foram identificadas a partir de gráficos (ln X) vs. (t), ou seja, valores do logaritmo neperiano da concentração celular (ln X) em função do tempo (t). Depois de determinar o período correspondente à fase exponencial, o melhor coeficiente de correlação foi obtido a partir de quatro (04) amostras coletadas durante a fase exponencial, e o módulo dos valores dos coeficientes angulares das regressões lineares de (ln X) vs. (t) revelaram os valores de µx. Os valores foram expressos em h-1.

O tempo de geração (tg) das linhagens foi obtido pela razão entre o valor do

logaritmo neperiano de 2 e o valor de µx apresentado pela respectiva linhagem, conforme

equação 26. Os valores foram expressos em h.

tg = ln2 / μx (26)

Para a obtenção do fator de conversão de substrato a células das linhagens (Yx/s)

foram traçados gráficos [X] vs. [Substrato], ou seja, valores da concentração de células em função da concentração de substrato, das amostras coletadas durante o período

correspondente à fase exponencial. Assim, o módulo dos coeficientes angulares das regressões lineares revelaram o Yx/sEXP. Os valores foram expressos em gDW.gsubstrato-1.

Supondo que a velocidade específica de consumo de substrato (μs) é máxima e

constante durante a fase exponencial de crescimento, o cálculo de μsExp foi realizado pela

razão entre o valor de μx e o valor de Yx/sExp, conforme equação 27. Os valores foram

expressos em h-1.

μsExp = μx / Yx/sExp (27)

Para a obtenção do fator de conversão de substrato a etanol exponencial das linhagens (YEth/sExp) foram traçados gráficos [Etanol] vs. [Substrato], ou seja, valores da

concentração de etanol em função da concentração de substrato, das amostras coletadas durante o período correspondente à fase exponencial. Assim, o módulo dos coeficientes angulares das regressões lineares revelaram o YEth/sExp. Os valores foram expressos em

gEth.gsubstrato-1. Para a obtenção do fator de conversão de substrato a etanol global das

linhagens (YEth/sGlo), foi calculada a razão entre os valores da concentração de etanol

produzido e da concentração de substrato consumido, quando a concentração máxima de etanol foi alcançada, conforme equação 28.

YEth/sGlo = [Etanol] / [Substrato] (28)

Supondo que a velocidade específica de produção de etanol (μEth) é máxima e

constante durante a fase exponencial de crescimento, o cálculo de μEthExp foi realizado pela

razão entre o valor de μx e o valor de YEth/sExp, conforme equação 29. Os valores foram

expressos em h-1.

μEthExp = μx / YEth/sExp (29)

A produtividade em etanol (PEth) foi calculada pela razão entre a concentração

máxima e o tempo necessário para obter a concentração máxima de etanol, conforme equação 30. A produção máxima de etanol foi expressa em g.(L.h)-1.