5 RESULTADOS E DISCUSSÃO
5.5 DETERMINAÇÃO DE CI 50 DOS EXTRATOS ATIVOS
Todos os extratos ativos dos fungos endofíticos foram avaliados em concentrações de 0,2 a 100 µg/mL para o cálculo e determinação da CI50, os quais exibiram valores que variaram de 0,2 a 20 µg/mL (Tabela 6). Os extratos dos táxons endofíticos identificados como Alternaria sp. apresentaram valores de CI50 entre 3,2 e 20 µg/mL contra L.
amazonensis. O táxon Alternaria sp. UFMGCB 2673 produziu o extrato com o menor valor
de CI50 (3,2 µg/mL). Espécies de Alternaria já foram descritas como produtoras de diferentes UFMGCB 2630
Phialophora mustea [AB190404] Helgardia aestiva [AY266145] Oculimacula acuformis [AY266146] Ypsilina graminea [GQ411306] Helgardia sp. [AM262430]
Rhynchosporium commune [HM627492] Helgardia anguioides [AY266144]
UFMGCB 2567 Ascomycota sp. [FN178473] Herpotrichia juniperi [FJ904492] UFMGCB 2682 Fungal sp. [HQ602655] UFMGCB 2661 Fungal sp. [FJ911881] Endophytic fungus [EU747157]
Trametes versicolor [AF042324] 98
98
69
Programa de Pós-graduação em Biotecnologia, Núcleo de Pesquisa em Ciências Biológicas da UFOP 44 metabólitos bioativos. Espécies de Alternaria têm sido caracterizadas quanto a atividade antimicrobiana contra Staphylococcus aureus e Candida albicans (CHRISTOPHERSEN et
al.,1999; FERNANDES et al.,2009; VAZ et al.,2009). Espécies deste gênero tem sido relatadas como produtoras de taxol, substância anticancerígena utilizada em diversos tratamentos (STROBEL et al. 1996; VURRO et al. 1998). Li et al. (2005) isolaram fungos endofíticos isolados de plantas medicinais chinesas e obtiveram 33% de isolados de
Alternaria sp. com atividade contra fungos patogênicos e/ou célula causadora de tumor
gástrico. Além disso, substâncias com atividades biológicas produzidas por Alternaria tem
sido isoladas e identificadas. Cota et al. (2008) isolaram a altenusina, substância com atividade contra enzima tripanotioma redutase, de um isolado de Alternaria sp. obtido da planta Trixis vauthieri DC (Asteraceae). Estes autores detectaram valores de CI50 de 0,3 a 4,3
µM para esta substância. Dois metabólitos, altechromona A e herbarin A, foram isolados a partir Alternaria brassicicola (Schwein.) Wiltshire, com atividade antimicrobiana (GU et al.,
2009).
O extrato do fungo Cadophora luteo-olivacea UFMGCB 2569 apresentou CI50 de 20 µg/mL contra L. amazonensis. O gênero Cadophora representa um dos Ascomycota responsáveis pela decomposição de matéria orgânica em ambientes Antárticos (DUNCAN et al.,2006; ARENZ & BLANCHETTE, 2009; BLANCHETTE et al., 2010). Cadophora luteo-
olivacea foi relatada como um fitopatógeno de Kiwi (PRODI et al., 2005), mas já foi obtido
como endofítico de plantas medicinais na China (CHEN et al., 2010). Na Antártica, esta espécie foi frequentemente encontrada em madeira em decomposição (BLANCHETTE et al., 2010), em amostra de solo (ARENZ et al., 2006; ARENZ & BLANCHETTE 2011), associados a musgos (TOSI et al., 2002) e de folhas de Colobanthus quitensis (ROSA et al. 2010).
O extrato de Davidiella tassiana UFMGCB 2455 apresentou atividade citotóxica seletiva contra a linhagem MCF-7, com valor de CI50 de 20 µg/mL. Davidiella tassiana já foi descrita como endofítico de diferentes plantas como: Pinus halepensis (Pinaceae)
(BOTELLA & DIEZ 2010), Colobanthus quitensis (ROSA et al., 2010), Dactylis glomerata
(Poaceae) (MARQUEZ, 2007) e Coffea arabica (Rubiaceae) (SETTE et al., 2006). Entretanto, não foram encontrados relatos de atividade biológicas produzidas por espécies de
Davidiella.
Os extratos obtidos de dois isolados de Microdochium phragmitis e um isolado de
Programa de Pós-graduação em Biotecnologia, Núcleo de Pesquisa em Ciências Biológicas da UFOP 45 respectivamente) apresentaram atividade citotóxica seletiva, com valores de CI50 entre 8 a 17 µg/mL, sobre a linhagem MCF-7 [valores estes abaixo do valor do etoposideo (16 µg/mL)].
Márquez et al. (2010) obtiveram espécies de Microdochium como endofíticas de Holcus
lanatus (Poaceae) e bambu (MORAKOTKARN et al. 2007). Zhang et al. (2008) obtiveram
quatro substâncias, três novos derivados de isocumarina e uma monocerina, bioativas de
Microdochium bolleyi [espécie endofítica associada a Fagonia cretica (Zygophyllaceae)],
com atividades antifúngica, antibacteriana e antialgal.
Dez extratos produzidos por táxons do gênero Phaeosphaeria mostraram atividade leishmanicida seletiva com valores de CI50 de 0,4 a 55 µg/mL. Entre os táxons de
Phaeosphaeria, o isolado UFMGCB 2669 se destacou por apresentar CI50 de 0,4 µg/mL,
valor próximo ao obtido para a anfotericina B. Espécies do gênero Phaeosphaeria foram descritas por Zhang et al. (2008) como produtoras de metabólitos com atividade antimicrobiana frente a Streptococcus pneumoniae e Candida albicans. Pittayakhajonwut et al. (2008) isolaram 11 metabólitos bioativos de espécies de Phaeosphaeria, que tiveram atividades antibacteriana (contra Mycobacterium tuberculosis) e citóxica (contra células tumorais renais, de pele, mama e pulmão.
Os isolados UFMGCB 2653, UFMGCB 2672 e UFMGCB 2687, fungos endofíticos não identificados obtidos de D. antarctica, apresentaram atividade leishmanicida seletiva com valores de CI50 entre 0,2 a 20 µg/mL. Estes isolados não puderam ser identificados pelos métodos moleculares utilizados neste estudo até o momento. Novas metodologias moleculares e a caracterização das estruturas de reprodução assexuada serão posteriormente utilizadas para a correta identificação destes isolados.
Programa de Pós-graduação em Biotecnologia, Núcleo de Pesquisa em Ciências Biológicas da UFOP 46 Tabela 6:. Valores de CI50 (μg/mL) dos extratos de fungos endofíticos bioativos.
Isolado de fungo endofítico aUFMGCB bUACC-62 cMCF-7 dTK-10 Morte de eLA
Alternaria sp. 1 2301 ntf nt nt 20 Alternaria sp. 2 2508 nt nt nt 20 Alternaria sp. 3 2564 nt nt nt 12,5 Alternaria sp. 4 2673 nt nt nt 3,2 Cadophora luteo-olivacea 2569 nt nt nt 20 Davidiella tassiana 2455 nt 20 nt nt Helgardia sp. 2630 nt nt nt 3,4 Herpotrichia sp. 2682 nt nt nt 3,5 Ypsilina graminea 2632 nt nt nt 20 Microdochium sp. 2290 nt 17 nt nt Microdochium phragmitis 2479 nt 8 nt nt Microdochium phragmitis 2656 nt 12,5 nt nt Oculimacula sp. 2567 nt nt nt 1,6 Phaeosphaeria herpotrichoides 2272 nt nt nt 20 Phaeosphaeria sp. 1 2515 nt nt nt 20 Phaeosphaeria sp. 2 2518 nt nt nt 20 Phaeosphaeria sp. 3 2528 nt nt nt 1,95
Programa de Pós-graduação em Biotecnologia, Núcleo de Pesquisa em Ciências Biológicas da UFOP 47 Phaeosphaeria sp. 4 2560 nt nt nt 7 Phaeosphaeria sp. 5 2649 nt nt nt 55 Phaeosphaeria sp.6 2650 nt nt nt 5 Phaeosphaeria sp. 7 2667 nt nt nt 20 Phaeosphaeria sp. 8 2669 nt nt nt 0,4 Fungo endofítico sp. 1 2653 nt nt nt 20 gFungo endofítico sp. 2 2661 nt nt 20 nt gFungo endofítico sp. 3 2256 nt nt nt 20 gFungo endofítico sp. 4 2629 nt nt nt 16,5 gFungo endofítico sp. 5 2659 nt nt nt 25,1 gFungo endofítico sp. 6 2666 nt nt nt 9,26 gFungo endofítico sp. 7 2670 nt nt nt 3,27 gFungo endofítico sp. 8 2672 nt nt nt 0,2 gFungo endofítico sp. 9 2687 nt nt nt 9,6 gFungo endofítico sp. 10 2697 nt nt nt 1,5 gFungo endofítico sp. 11 2794 20 nt nt nt
Drogas controles etoposideo 16 16 16 nt
anfotericina B nt nt nt 0,2
aUFMGCB = Coleção de Microrganismos e Células da Universidade Federal de Minas Gerais. bMCF-7 = glândula mamária, cUACC-62 = melanoma, dTK-10 = renal, eLA = Leishmania amazonensis, fnt = não testado. gFungos não identificados que não foram obtidos amplicons para seqüenciamento.
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CONCLUSÕES
Nos últimos anos, alguns estudos vêm demonstrando a importância ecológica, evolutiva e biotecnológica dos fungos endofíticos associados a plantas de diferentes ecossistemas do planeta. Entretanto, poucos dados foram gerados referentes a diversidade e aplicações biotecnológicas do fungos presentes nas condições extremas da Antártica. O isolamento de 564 fungos endofíticos associados as angiospemas presntes na Antártica indica que estas plantas representam um reservatório promissor e reforça a importância de estudos que visem a caracterização de microrganismos presentes em ambientes extremos.
Os extratos de nove gêneros de fungos associados as angiospermas antárticas apresentaram-se ativos contra os alvos testados: Alternaria, Cadophora, Davidiella,
Helgardia, Herpotrichia, Microdochium, Oculimacula, Phaeosphaeria e Ypsilina. Este
resultado sugere a capacidade de produção de moléculas bioativas promissoras, as quais podem representar protótipos para o desenvovimento de drogas citotóxicas e antiparasitárias.
Os isolados do gênero Microdochium apresentaram atividade citotóxica seletiva, indicando que estes isolados possam representar fungos promissores quanto a produção de moléculas antitumorais; por outro lado, o Phaeosphaeria sp. UFMGCB 2669 apresentou o melhor valor de CI50 sobre as formas amastigotas de L. amazonensis. Estes resultados indicam que estes fungos são bons candidatos para estudos fermentativos e de fracionamento químico para o isolamento da(s) substância(s) citotóxicas e leishmanicidas.
Por fim, os resultados obtidos neste projeto indicam qua a micobiota endofítica das duas únicas angiospermas que habitam a Antártica (C. quitensis e D. antarctica) constitui uma fonte promissora de metabólitos bioativos. Em paralelo, este trabalho abre novas perspectivas de estudo de outras organismos da Antártica (tais como espécies de musgos, macroalgas e fungos liquenizados) como fonte de fungos produtores de moléculas biativas.
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