A técnica preferencial para determinação de resíduos de medicamentos veterinários em amostras de peixe é a cromatografia líquida acoplada à espectrometria de massas em série (LC-MS/MS, do inglês Liquid Chromatography
coupled to tandem Mass Spectrometry) ou LC acoplada a espectrômetros de massas
de alta resolução (HRMS, do inglês High Resolution Mass Spectrometry). O acoplamento destas duas técnicas permite a determinação de mais de uma classe de medicamento simultaneamente. Ou seja, mais de um sinal analítico pode ser monitorado enquanto mais de um composto é eluído da coluna. A quantidade de dados adquirida é incomparável com métodos espectrofotométricos de detecção, por exemplo. Neste contexto, os métodos multiressíduo estão ganhando espaço na determinação de resíduos de medicamentos de uso veterinário. Estes métodos representam o futuro deste campo, sendo limitados apenas pelo processo de extração, uma vez que é notável a dificuldade de proporcionar recuperações aceitáveis (70-120%) de analitos com distintas propriedades físico-químicas (SANTOS & RAMOS, 2016).
A Tabela 3 apresenta diferentes métodos cromatográficos para a determinação de diversas classes de medicamentos veterinários. Todos os métodos apresentados na Tabela 4 utilizam o modo de fase-reversa com colunas cromatográficas contendo recheios diferentes e dimensões variadas. Percebe-se que os volumes de injeção utilizados variam entre 1 e 50 µL, a temperatura da coluna varia entre 25 e 60 °C, com vazões entre 0,1 e 1,0 mL min-1, e tempos totais de análise cromatográfica entre 3,7
e 33,0 min. Os solventes orgânicos empregados como fase móvel são acetonitrila e metanol. Por fim, ácido heptafluorbutírico, ácido fórmico, formiato de amônio, acetato de amônio e ácido oxálico são utilizados como aditivos, visando melhorar a separação e o formato dos picos e auxiliar na formação de íons pseudo-moleculares na fonte de ionização.
Tabela 3 – Volumes de injeção, colunas, temperaturas da coluna, fase móvel, vazão e tempo total de análise cromatográfica aplicadas na determinação de resíduos de medicamentos veterinários em amostras de peixe.
Analitos Volume de injeção (µL) Coluna Temperatura
(oC) Fase móvel aquosa Fase móvel orgânica
Vazão (mL min-1) Tempo (min) Referência Aminoglicosídeos 5 C18 (150 x 2,1 mm, 2,6 µm) 25 Água (5% Acetonitrila) 0,13% ácido heptafluorobutírico Acetonitrila (5% Água) 0,13% ácido heptafluorobutírico 0,3 9 (KAUFMANN ET AL., 2012) - C18 (50 x 4,6 mm, 3 µm) 35 Água 0,025% ácido
heptafluorobutirico Acetonitrila 0,25 18 (GBYLIK et al., 2013) 10 C18 (XDB) (150 x 4,6 mm, 1,8 µm) - Água 0,1% ácido
heptafluorobutirico Acetonitrila 0,6 15 (GUIDI et al., 2017)
Anfenicóis
20 C18 (150 x 4,6 mm, 5 µm) - Água Acetonitrila 0,8 10 (BARRETO et al., 2012) 10 C18 (BEH) (50 x 2,1 mm, 1,7 µm) 40 Água Metanol 0,4 5 (PAN et al., 2015)
5 Fenil (BEH) (50 x 2,1 mm, 1,7 µm) 30 Água 0,05 % ácido fórmico Acetonitrila 0,3 4 (HUANG et al., 2016) 20 HSS T3 (100 x 2,1 mm, 1,8 µm) 40 Água 0,1 % ácido fórmico Acetonitrila 0,45 12 (FREITAS et al., 2014) 10 C18 (100 x 3 mm, 3,5 µm) 30 Água 0,1 % ácido fórmico Acetonitrila 0,1 % ácido
fórmico 0,4 25 (MONTEIRO et al., 2015) 20 HSS T3 (100 x 2,1 mm, 1,8 µm) 40 Água 0,1 % ácido fórmico Acetonitrila 0,45 12 (SANTOS et al., 2016) 10 C18 (150 x 2,1 mm, 5 µm) 40 Água 0,1 % ácido fórmico,
5 mM acetato de amônio Metanol 0,2 21 (TAO et al., 2012)
20 C18 (50 x 2 mm, 2,5 µm) - Água 0,2% Ácido fórmico 0,1 mM ácido oxálico
Acetonitrila 0,2% Ácido fórmico 0,1 mM ácido
oxálico
0,3 7,2 (YIPEL et al., 2016)
10 C18 (Xterra) (5 x 2,1 mm, 1,7 µm) 40 Água 2 mM Acetato de amônio Acetonitrila 2 mM Acetato de amônio 0,3 10 (BARRETO et al., 2016)
5 C18 (BEH) (50 x 2,1 mm, 1,7 µm) - Água 5 mM Acetato de
amônio pH 8 Acetonitrila 0,5 3,7 (SERRA-COMPTE et al., 2016) Benzimidazóis 10 C18 (150 x 2,1 mm, 2,6 µm) 25 Água (5% Acetonitrila)
0,3% ácido fórmico
Acetonitrila (5% Água)
0,3% ácido fórmico 0,4-0,8 14 (KAUFMANN et al., 2011)
Beta-lactâmicos
- C18 (50 x 4,6 mm, 3 µm) 36 Água 0,025% ácido
heptafluorobutirico Acetonitrila 0,25 18 (GBYLIK et al., 2013) 10 HSS T3 (100 x 2,1 mm, 1,8 µm) - Água 0,05% ácido fórmico Acetonitrila 0,3 20 (TANG et al., 2012)
Analitos Volume de injeção (µL) Coluna Temperatura
(oC) Fase móvel aquosa Fase móvel orgânica
Vazão (mL min-1)
Tempo
(min) Referência
Cefalosporinas
10 C18 (150 x 2,1 mm, 2,6 µm) 25 Água (5% Acetonitrila) 0,3% ácido fórmico Acetonitrila (5% Água) 0,3% ácido fórmico 0,4-0,8 14 (KAUFMANN et al., 2011)
10 (100 x 2,1 mm, 1,9 µm) 30 Água 0,1 % ácido fórmico Acetonitrila 0,1 % ácido
fórmico 0,3 15 (REINHOLDS et al., 2016) 10 C18 - Água 0,1 % ácido fórmico,
0,1% formiato de amônio Metanol:Acetonitrila 0,15 33 (DONE & HALDEN, 2015)
20 C18 (50 x 2 mm, 2,5 µm) - Água 0,2% Ácido fórmico 0,1 mM ácido oxálico
Acetonitrila 0,2% Ácido fórmico 0,1 mM ácido
oxálico
0,3 7,2 (YIPEL et al., 2016)
Corantes 5 Fenil (BEH) (50 x 2,1 mm, 1,7 µm) 30 Água 0,05 % ácido fórmico Acetonitrila 0,3 4 (HUANG et al., 2016)
Lincosamidas
10 HSS T3 (100 x 2,1 mm, 1,8 µm) - Água 0,05% ácido fórmico Acetonitrila 0,3 20 (TANG et al., 2012) 5 C18 (100 x 2,1 mm, 2,6 µm) 40 Água 0,1 % ácido fórmico Acetonitrila 0,2 21 (DICKSON, 2014) 5 HSS T3 (50 x 2,1 mm, 1,8 µm) - Água 0,1 % ácido fórmico Acetonitrila 0,5 6 (SERRA-COMPTE et al., 2016)
Macrolídeos
10 C18 (150 x 2,1 mm, 2,6 µm) 25 Água (5% Acetonitrila) 0,3% ácido fórmico
Acetonitrila (5% Água)
0,3% ácido fórmico 0,4-0,8 14 (KAUFMANN et al., 2011) - C18 (50 x 4,6 mm, 3 µm) 38 Água 0,025% ácido heptafluorobutirico Acetonitrila 0,25 18 (GBYLIK et al., 2013) 10 HSS T3 (100 x 2,1 mm, 1,8 µm) - Água 0,05% ácido fórmico Acetonitrila 0,3 20 (TANG et al., 2012)
5 C18 (100 x 2,1 mm, 2,6 µm) 40 Água 0,1 % ácido fórmico Acetonitrila 0,2 21 (DICKSON, 2014) 20 HSS T3 (100 x 2,1 mm, 1,8 µm) 40 Água 0,1 % ácido fórmico Acetonitrila 0,45 12 (FREITAS et al., 2014) 10 (100 x 2,1 mm, 1,9 µm) 30 Água 0,1 % ácido fórmico Acetonitrila 0,1 % ácido
fórmico 0,3 15 (REINHOLDS et al., 2016) 20 HSS T3 (100 x 2,1 mm, 1,8 µm) 40 Água 0,1 % ácido fórmico Acetonitrila 0,45 12 (SANTOS et al., 2016)
5 HSS T3 (50 x 2,1 mm, 1,8 µm) - Água 0,1 % ácido fórmico Acetonitrila 0,5 6 (SERRA-COMPTE et al., 2016)
10 C18 - Água 0,1 % ácido fórmico, 0,1% formiato de amônio Metanol:Acetonitrila 0,15 33 (DONE & HALDEN, 2015)
10 C18 (XDB) (150 x 4,6 mm, 1,8 µm) - Água 0,1% ácido
heptafluorobutirico Acetonitrila 0,6 15 (GUIDI et al., 2017)
20 C18 (50 x 2 mm, 2,5 µm) - Água 0,2% Ácido fórmico 0,1 mM ácido oxálico
Acetonitrila 0,2% Ácido fórmico 0,1 mM ácido
oxálico
0,3 7,2 (YIPEL et al., 2016)
Nitroimidazóis 10 C18 (150 x 2,1 mm, 2,6 µm) 25 Água (5% Acetonitrila) 0,3% ácido fórmico
Acetonitrila (5% Água)
Analitos Volume de injeção (µL) Coluna Temperatura
(oC) Fase móvel aquosa Fase móvel orgânica
Vazão (mL min-1)
Tempo
(min) Referência
Nitroimidazóis
10 C18 (BEH) (100 x 2,1 mm, 1,7 µm) 60 Água 0,01 % ácido fórmico Metanol 0,01 % ácido fórmico 0,45 8 (GADAJ et al., 2014) 5 Fenil (BEH) (50 x 2,1 mm, 1,7 µm) 30 Água 0,05 % ácido fórmico Acetonitrila 0,3 4 (HUANG et al., 2016) 5 HSS T3 (50 x 2,1 mm, 1,8 µm) - Água 0,1 % ácido fórmico Acetonitrila 0,5 6 (SERRA-COMPTE et al., 2016)
Penicilinas
10 C18 (150 x 2,1 mm, 2,6 µm) 25 Água (5% Acetonitrila) 0,3% ácido fórmico
Acetonitrila (5% Água)
0,3% ácido fórmico 0,4-0,8 14 (KAUFMANN et al., 2011) 20 HSS T3 (100 x 2,1 mm, 1,8 µm) 40 Água 0,1 % ácido fórmico Acetonitrila 0,45 12 (FREITAS et al., 2014) 10 (100 x 2,1 mm, 1,9 µm) 30 Água 0,1 % ácido fórmico Acetonitrila 0,1 % ácido
fórmico 0,3 15 (REINHOLDS et al., 2016) 20 HSS T3 (100 x 2,1 mm, 1,8 µm) 40 Água 0,1 % ácido fórmico Acetonitrila 0,45 12 (SANTOS et al., 2016) 10 C18 - Água 0,1 % ácido fórmico,
0,1% formiato de amônio Metanol:Acetonitrila 0,15 33 (DONE & HALDEN, 2015)
20 C18 (50 x 2 mm, 2,5 µm) - Água 0,2% Ácido fórmico 0,1 mM ácido oxálico Acetonitrila 0,2% Ácido fórmico 0,1 mM ácido oxálico 0,3 7,2 (YIPEL et al., 2016) Quinolonas 10 C18 (150 x 2,1 mm, 2,6 µm) 25 Água (5% Acetonitrila) 0,3% ácido fórmico Acetonitrila (5% Água)
0,3% ácido fórmico 0,4-0,8 14 (KAUFMANN et al., 2011) - C18 (50 x 4,6 mm, 3 µm) 37 Água 0,025% ácido heptafluorobutirico Acetonitrila 0,25 18 (GBYLIK et al., 2013) 10 HSS T3 (100 x 2,1 mm, 1,8 µm) - Água 0,05% ácido fórmico Acetonitrila 0,3 20 (TANG et al., 2012) 20 HSS T3 (100 x 2,1 mm, 1,8 µm) 40 Água 0,1 % ácido fórmico Acetonitrila 0,45 12 (FREITAS et al., 2014) 10 C18 (100 x 3 mm, 3,5 µm) 30 Água 0,1 % ácido fórmico Acetonitrila 0,1 % ácido
fórmico 0,4 25 (MONTEIRO et al., 2015) 10 (100 x 2,1 mm, 1,9 µm) 30 Água 0,1 % ácido fórmico Acetonitrila 0,1 % ácido
fórmico 0,3 15 (REINHOLDS et al., 2016) 20 HSS T3 (100 x 2,1 mm, 1,8 µm) 40 Água 0,1 % ácido fórmico Acetonitrila 0,45 12 (SANTOS et al., 2016) 10 C18 - Água 0,1 % ácido fórmico,
0,1% formiato de amônio Metanol:Acetonitrila 0,15 33 (DONE & HALDEN, 2015) 10 C18 (XDB) (150 x 4,6 mm, 1,8 µm) - Água 0,1% ácido
heptafluorobutirico Acetonitrila 0,6 15 (GUIDI et al., 2017) 1 C18 (20 x 3 mm, 5 µm) - Água 0,2 % ácido fórmico Acetonitrila 0,2 % ácido
Analitos Volume de injeção (µL) Coluna Temperatura
(oC) Fase móvel aquosa Fase móvel orgânica
Vazão (mL min-1)
Tempo
(min) Referência
Quinolonas 20 C18 (50 x 2 mm, 2,5 µm) -
Água 0,2% Ácido fórmico 0,1 mM ácido oxálico
Acetonitrila 0,2% Ácido fórmico 0,1 mM ácido
oxálico
0,3 7,2 (YIPEL et al., 2016)
5 C18 (BEH) (50 x 2,1 mm, 1,7 µm) - Água pH 2,5 Metanol pH 2,5 0,3 9 (AUFARTOVÁ et al., 2017)
Sulfonamidas
10 C18 (150 x 2,1 mm, 2,6 µm) 25 Água (5% Acetonitrila) 0,3% ácido fórmico
Acetonitrila (5% Água)
0,3% ácido fórmico 0,4-0,8 14 (KAUFMANN et al., 2011) - C18 (50 x 4,6 mm, 3 µm) 39 Água 0,025% ácido
heptafluorobutirico Acetonitrila 0,25 18 (GBYLIK et al., 2013) 20 C18 (150 x 2,1 mm, 5 µm) 25 Água 0,1 % ácido fórmico Acetonitrila 0,3 10 (CHÁFER-PERICÁS et al., 2011) 10 C18 (50 x 2,1 mm, 1,8 µm) - Água 0,1 % ácido fórmico Acetonitrila 0,1 21 (DASENAKI & THOMAIDIS, 2010). 20 HSS T3 (100 x 2,1 mm, 1,8 µm) 40 Água 0,1 % ácido fórmico Acetonitrila 0,45 12 (FREITAS et al., 2014)
3 C18 (100 x 4,0 mm, 5 µm) 40 Água 0,1 % ácido fórmico Metanol 0,2 8 (LI et al., 2016) 10 C18 (100 x 3 mm, 3,5 µm) 30 Água 0,1 % ácido fórmico Acetonitrila 0,1 % ácido
fórmico 0,4 25 (MONTEIRO et al., 2015) 10 (100 x 2,1 mm, 1,9 µm) 30 Água 0,1 % ácido fórmico Acetonitrila 0,1 % ácido
fórmico 0,3 15 (REINHOLDS et al., 2016) 20 HSS T3 (100 x 2,1 mm, 1,8 µm) 40 Água 0,1 % ácido fórmico Acetonitrila 0,45 12 (SANTOS et al., 2016)
5 HSS T3 (50 x 2,1 mm, 1,8 µm) - Água 0,1 % ácido fórmico Acetonitrila 0,5 6 (SERRA-COMPTE et al., 2016) 10 C18 - Água 0,1 % ácido fórmico,
0,1% formiato de amônio Metanol:Acetonitrila 0,15 33 (DONE & HALDEN, 2015) 10 C18 (XDB) (150 x 4,6 mm, 1,8 µm) - Água 0,1% ácido
heptafluorobutirico Acetonitrila 0,6 15 (GUIDI et al., 2017)
20 C18 (50 x 2 mm, 2,5 µm) - Água 0,2% Ácido fórmico 0,1 mM ácido oxálico
Acetonitrila 0,2% Ácido fórmico 0,1 mM ácido
oxálico
0,3 7,2 (YIPEL et al., 2016)
20 C18 (Eclipse Plus)) (100 x 2,1 mm, 1,8 µm) 40 Água 10 mM ácido fórmico Acetonitrila 10 mM ácido
fórmico 0,2 10 (JANSOMBOON et al., 2016)
Tetraciclinas
10 C18 (150 x 2,1 mm, 2,6 µm) 25 Água (5% Acetonitrila) 0,3% ácido fórmico
Acetonitrila (5% Água)
0,3% ácido fórmico 0,4-0,8 14 (KAUFMANN et al., 2011) - C18 (50 x 4,6 mm, 3 µm) 40 Água 0,025% ácido
heptafluorobutirico Acetonitrila 0,25 18 (GBYLIK et al., 2013) 20 C18 (150 x 2,1 mm, 5 µm) 25 Água 0,1 % ácido fórmico Acetonitrila 0,3 10 (CHÁFER-PERICÁS et al., 2011) 10 C18 (50 x 2,1 mm, 1,8 µm) - Água 0,1 % ácido fórmico Acetonitrila 0,1 21 (DASENAKI & THOMAIDIS, 2010).
Analitos Volume de injeção (µL) Coluna Temperatura
(oC) Fase móvel aquosa Fase móvel orgânica
Vazão (mL min-1)
Tempo
(min) Referência
Tetraciclinas
20 HSS T3 (100 x 2,1 mm, 1,8 µm) 40 Água 0,1 % ácido fórmico Acetonitrila 0,45 12 (FREITAS et al., 2014) 10 C18 (100 x 3 mm, 3,5 µm) 30 Água 0,1 % ácido fórmico Acetonitrila 0,1 % ácido
fórmico 0,4 25 (MONTEIRO et al., 2015) 10 (100 x 2,1 mm, 1,9 µm) 30 Água 0,1 % ácido fórmico Acetonitrila 0,1 % ácido
fórmico 0,3 15 (REINHOLDS et al., 2016) 20 HSS T3 (100 x 2,1 mm, 1,8 µm) 40 Água 0,1 % ácido fórmico Acetonitrila 0,45 12 (SANTOS et al., 2016)
5 HSS T3 (50 x 2,1 mm, 1,8 µm) - Água 0,1 % ácido fórmico Acetonitrila 0,5 6 (SERRA-COMPTE et al., 2016) 50 C18 (150 x 4,6 mm, 5 µm) 35 Água 0,1 mM ácido oxálico Metanol:Acetonitrila 1 18 (LIU et al., 2013) 10 C18 (XDB) (150 x 4,6 mm, 1,8 µm) - Água 0,1% ácido
heptafluorobutirico Acetonitrila 0,6 15 (GUIDI et al., 2017)
20 C18 (50 x 2 mm, 2,5 µm) - Água 0,2% Ácido fórmico 0,1 mM ácido oxálico
Acetonitrila 0,2% Ácido fórmico 0,1 mM ácido
oxálico
0,3 7,2 (YIPEL et al., 2016)
10 C18 - Água 0,5% Ácido fórmico 0,5 mM ácido oxálico
Metanol:Acetonitrila (1:1) 0,5% Ácido fórmico 0,5 mM
ácido oxálico
0,2 30 (DONE & HALDEN, 2015)
20 C18 (250 x 4,6 mm, 5 µm) 35
Água acetato de sódio, cloreto de cálcio, EDTA,
pH 7
Metanol:Acetonitrila 1 18 (ORLANDO & SIMIONATO, 2013)
Tranquilizantes 10 C18 (150 x 2,1 mm, 2,6 µm) 25 Água (5% Acetonitrila) 0,3% ácido fórmico
Acetonitrila (5% Água)
VALIDAÇÃO DE MÉTODOS ANALÍTICOS
Em guia voltado para a validação e controle de qualidade analítica para fármacos em produtos para aliementação animal e medicamentos veterinários, o MAPA, em 2011, define:
A validação de determinado procedimento analítico objetiva demonstrar que o mesmo é adequado aos objetivos propostos, ou seja, que os parâmetros de desempenho avaliados atendem aos critérios de aceitação preconizados. Trata-se de é um estudo experimental e integralmente documentado (MAPA, 2011).
Em 2010, a ANVISA publicou o “Guia para validação de métodos analíticos e bioanalíticos”. Segundo este guia, o objetivo da etapa de validação é a demonstração da apropriação de uma metodologia analítica para uma finalidade pretendida. Em 2017, a União Europeia publicou o guia de controle de qualidade analítica que descreve as exigências para a validação de metodologias analíticas, direcionado para a determinação de resíduos e contaminantes (em especial agrotóxicos) em alimentos (SANTE, 2017). Os objetivos do guia são; a harmonização de sistemas de controle de qualidade; garantir a qualidade e a comparabilidade de resultados; estabelecer uma exatidão aceitável; evitar resultados falso-positivos e falso-negativos; servir de apoio a implementação do sistema ISO/IEC 17025:2005. A definição de validação, neste caso, é a confirmação, através da obtenção de evidências objetivas, que todas as exigências foram cumpridas. No Brasil, o Instituto Nacional de Metrologia Normalização e Qualidade Industrial (INMETRO), em julho de 2018 publicou um compêndio de orientações sobre validação de métodos de ensaios químicos (INMETRO, 2018).
Além destes, em agosto de 2002, a comissão das comunidades europeias publicou um documento a respeito da performance analítica de métodos e interpretação de resultados na determinação de resíduos em produtos de origem animal. A validação definida neste documento é semelhante às referências citadas (CD/657/2002).
Alguns dos parâmetros avaliados durante a etapa de validação estão representados na Tabela 4.
Tabela 4 – Parâmetros avaliados durante a etapa de validação de métodos analíticos para determinação de resíduos de medicamentos veterinários por cromatografia líquida acoplada a espectrometria de massas
Parâmetro Referência Definição Aplicação
Seletividade INMETRO
Distinção de resposta entre analitos,
Extração de matriz “branco”. Razão entre íons de identificação e
quantificação (desvio ± 30%) ANVISA Distinção da resposta do
analito na presença de interferentes, Especificidade EU CD/657/02
Linearidade INMETRO ANVISA
Correlação entre resposta analítica e concentração Curva Analítica (y = ax + b) Faixa Linear de trabalho INMETRO ANVISA Intervalo de concentrações em que y e x correlacionam-se linearmente Curva Analítica (y = ax + b)
Efeito Matriz Gosetti, 2010 Influência dos componentes da matriz na resposta (y)
Comparação entre curvas preparadas em solvente e em extrato branco Limite de detecção (LOD) INMETRO ANVISA Concentração limite de distinção entre analito e
ruído S/R = 3 Limite de quantificação (LOQ) S/R = 10 Limite de decisão (CCα) EU CD/657/02 Limite de concentração passível de decisão/confirmação com propabilidade de erro α/β CCα = (Ref) + 1,64(Desvio padrão) Capacidade de detecção (CCβ) CCβ = CCα + 1,64(Desvio padrão) Precisão INMETRO ANVISA Proximidade de resultados obtidos por diferentes
amostragens Repetibilidade e Reprodutibilidade Exatidão INMETRO ANVISA Proximidade de resultado em relação à uma referência Ensaios de fortificação