DETERMINAÇÃO DE VITAMINA A POR CLAE EM LEITES E COMPOSTOS

3.3.1. Seleção de amostras

As amostras de leites e compostos lácteos enriquecidos com vitamina A que tiveram seus rótulos avaliados foram adquiridas nos supermercados e conduzidas ao Laboratório de Bioquímica da Nutrição da Escola de Nutrição da Universidade Federal da Bahia sendo submetidas à determinação de vitamina A por CLAE.

Encontravam-se disponíveis, nos sete supermercados visitados, dez produtos do grupo III (leites em geral) enriquecidos com vitamina A, sendo coletadas amostras de três lotes de cada produto, configurando um total de 30 amostras, sendo 21 amostras de leite em pó, 6 de compostos lácteos e 3 amostras de leite fluido.

3.3.2. Preparo das amostras

Para a determinação do teor de retinol as amostras de leite em pó e de compostos lácteos enriquecidas com vitamina A, foram pesadas em balança analítica (Acculab

Sartorius Group) e reconstituídas de acordo com as instruções constantes nos

rótulos, com água purificada em sistema Milli-Q (Millipore, Bedford, MA, EUA). As amostras de leite fluido foram transferidas diretamente para os balões volumétricos.

A determinação do retinol foi realizada por Cromatografia Líquida de Alta Eficiência segundo Giuliano e colaboradores (1992), modificada, como descrito por Soares, Sousa, Dimenstein (2008). Para tanto, 500 µL de leite foi acrescido de 500 µL de etanol absoluto (Merck) agitando-se por 10 segundos (Vórtex) e 1 ml de hidróxido de potássio (Qhemis) aquoso 50% v/v, para a etapa de hidrólise alcalina. As amostras foram homogeneizadas durante 1 minuto (Vórtex) e submetidas ao banho-maria sob agitação a 45 ºC por 2 h. Em seguida, foi adicionado 1 ml de hexano (Mallinckrodt) como reagente extrativo, agitando-se por 1 minuto (Vórtex) para posterior centrifugação a 4000 rpm por dez minutos (centrífuga FANEM, 206R). A camada hexânica foi removida para outro tubo, repetindo-se o processo de extração por mais duas vezes. Uma alíquota de 1500 µL do sobrenadante foi evaporada sob atmosfera de nitrogênio, em banho-maria a 37 °C e o extrato s eco foi suspenso em 250 µL de metanol grau cromatográfico (JTBacker) agitado e filtrado em membrana de polietileno poro 0,22 µm (Vertical) direto nos vials, e submetido à análise por CLAE. Todas as determinações foram realizadas em triplicata. A representação esquemática da metodologia de extração e determinação de retinol por CLAE está apresentada na Figura 4, com fotos das etapas de análise exibidas no Anexo A.

Todos os solventes utilizados foram de grau cromatográfico e previamente filtrados em sistema Millipore de filtração a vácuo, com membrana para solvente orgânico de 0,45 µm.

FIGURA 4: Representação esquemática do método para determinação de retinol em leites e compostos lácteos enriquecidos por CLAE

Devido à alta sensibilidade do retinol à luz e à oxidação, todas as atividades operacionais foram realizadas sob condições reduzidas de iluminação, e os extratos submetidos à análise por CLAE no mesmo dia de extração.

500 µl de leite + 500 µl etanol (agitação 10s) + 1.000µl de KOH (agitação 1 min)

Leite em pó: pesagem e reconstituição em balão volumétrico

Banho-maria 2h a 45°C

1.500 µl, secagem sob N2 a 37° C

Extrato seco + 250 µl de metanol, filtração e análise em CLAE

Leite fluido: volume transferido para balão volumétrico

Adição 1 ml hexano (agitação 1min) Centrifugação 10 min a 4.000 RPM

700 µl de extrato hexânico

+ 1 ml hexano (agitação 1min) Centrifugação 10 min a 4.000 RPM

Precipitado

1000 µl de extrato hexânico Precipitado

+ 1 ml hexano (agitação 1min) Centrifugação por 10 min a 4.000 RPM

1000 µl de extrato hexânico

3.3.3. Condições cromatográficas

As amostras foram analisadas por CLAE em cromatógrafo líquido de alta eficiência com sistema quaternário de bombeamento de solventes (Waters, Alliance 2695), detector de arranjo de diodos (DAD - Waters, 2998), injetor automático, desgaseificador “on line” e sistema de aquisição e processamento de dados através do Software Empower 2 (Waters), com uma coluna X-Terra MS C18 Waters 3,9 mm x

150 mm (5 µm) e coluna de guarda (Waters – Adsorption 4mg-40 mg). A eluição evoluiu em fase móvel isocrática 100% metanol, com fluxo de 1,0 ml/min e volume de injeção de 20 µL. O comprimento de onda adotado para o monitoramento da absorbância foi de 325 nm.

A identificação e quantificação do retinol nas amostras foram estabelecidas por comparação com o tempo de retenção e a área do padrão de all-trans-retinol (SIGMA, 95% de pureza).

Os valores encontrados foram expressos em µg/ml e µg/g e comparados com os estabelecidos pela legislação vigente para a categoria de produtos enriquecidos, bem como com os valores declarados nos rótulos dos produtos.

3.3.4. Validação da metodologia analítica

3.3.4.1. Linearidade

A linearidade foi avaliada pela construção da curva de calibração através de padronização externa com soluções analíticas do padrão de all-trans-retinol, com concentrações variando de 0,01 µg/ml a 3 µg/ml. Cada solução foi injetada nove vezes e os dados de regressão linear obtidos com auxílio do software do equipamento (Empower 2 Waters).

3.3.4.2. Limite de Detecção (LOD) e Limite de Quantificação (LOQ)

Limite de Detecção (LOD) é definido como a menor concentração do analito possível de ser detectada com base no método em validação e o Limite de Quantificação

(LOQ) a menor concentração da substância em exame que pode ser quantificada pelo método, sendo expressos através das seguintes equações:

Equação 1: LOD = 3,3 x SD/s Equação 2: LOQ = 10 x SD/s Onde:

SD é a estimativa do desvio padrão da resposta; s é a inclinação da curva analítica.

3.3.4.3. Precisão

A precisão foi avaliada a partir da repetitividade, sendo realizadas nove injeções sucessivas da solução padrão de all-trans-retinol, em onze níveis diferentes de concentração, pelo mesmo analista, sendo determinados o desvio padrão e o coeficiente de variação das áreas obtidas.

3.3.4.4. Recuperação

Testes de recuperação foram realizados com a adição de soluções padrões de retinol a uma amostra de leite em pó não enriquecido, logo após a reconstituição da mesma, em dois níveis de concentração: 0,42 µg/ml e 0,91 µg/ml. Após a fortificação, as amostras e o branco (leite reconstituído não enriquecido) foram submetidos aos procedimentos de extração descritos no item 3.2.2, (excluindo-se a etapa de saponificação) seguido de análise por CLAE, sendo as determinações realizadas em triplicata.

A concentração da solução padrão de retinol em etanol foi confirmada através da leitura da absorbância em Espectrofotômetro UV/VIS (Perkin Elmer, Lambda 25), a 325 nm, utilizando-se coeficiente de extinção específico A1%1cm = 1835, em etanol

absoluto, de acordo com equação 3:

Equação 3: x(µg)= A.y(ml) . 104

/ A1%1cm

Onde:

y= volume da solução

A1%1cm= coeficiente de absorção do retinol no solvente usado

Os valores de recuperação foram calculados de acordo com a equação 4:

Equação 4: % de recuperação = (Ca - Cb)/Cp.100 Onde:

Ca= concentração de retinol na amostra enriquecida Cb= concentração de retinol do branco analítico Cp= concentração do padrão adicionado

Após a realização dos testes de validação do método as determinações de retinol foram realizadas conforme descrito nos itens 3.3.2 e 3.3.3.

3.4. DETERMINAÇÃO DE FERRO POR FAAS EM LEITES E COMPOSTOS